甜菜亚硝酸还原酶(NiR)基因的克隆及其表达分析

摘要

甜菜是我国北方特有的糖料作物,在我国北方农业生产中占有重要地位。其产量仅次于甘蔗,甜菜糖占世界食糖总量的30％左右。在世界产糖大国中,我国是少数既产甜菜糖又产甘蔗糖的国家之一,我国甜菜的种植面积最高年份达67万公顷,居世界第3位,总产量居世界第6位。然而,目前黑龙江省乃至全国甜菜单产不高、总产不稳,特别是含糖率呈下降趋势,已成为限制我国甜菜糖业发展的障碍性因子。究其原因,除品种选育滞后外,氮素供应不合理是主要原因之一。由于氮源和氮素代谢在作物产量中发挥着中心作用,确定氮素状态调控的基因网络,鉴定重要基因的功能,阐明该基因表达蛋白生化特性,将对农业发展有着广泛的影响。在甜菜所需的全部营养中,氮素是影响产量的最关键、最活跃因素,氮素过量会造成甜菜产糖量的降低。硝态氮(NO3-)是旱田作物可利用氮素的主要形式,NR是NO3-无机同化的限速酶,NiR是NO3-无机同化的控制酶。与NR相比较,有关NiR研究尚少。
　　 亚硝酸还原酶(NiR)是氮素同化途径的关键酶,由于NiR活力一般要比NR活力高得多,所以NiR作为硝酸盐还原的限制步骤的可能性就被排除了,致使国内外以往的初级氮素同化研究忽略了NiR的控制酶作用,造成氮的无机同化代谢研究偏重于NR的不平衡局面。本研究借助现代分子生物学手段,首次克隆甜菜亚硝酸还原酶编码基因的eDNA全长序列以及基因组gDNA全长序列;首次确定了甜菜亚硝酸还原酶基因编码蛋白的多肽序列和功能区域;首次推测出甜菜亚硝酸还原酶蛋白的3D构象;并通过实时荧光定量PCR的方法(RT-PCR),在转录水平上研究该基因在NO3-N和NH4+-N两种不同形态氮素条件下以及NO3-N和NH4+-N分别处理不同浓度下的表达变化,揭示氮素条件和甜菜NiR基因表达的关系;另外在氮素诱导的基础上,设置不同浓度蛋白抑制剂放线菌酮处理,以及NO2-处理和NaCl处理,研究甜菜NiR基因的表达;初步研究了环境因子对于亚硝酸还原酶基因表达的影响。具体的研究内容和结论如下:
　　 1.根据GenBank已知甜菜部分DNA序列(AF173663)和菠菜mRNA(X07568)全长序列,进行同源比对,在保守区设计巢式PCR引物,利用RACE方法扩增得到甜菜亚硝酸还原酶基因的5'和3'未知区域。
　　 2.依据得到的5'和3'序列设计引物,扩增得到中间片段P0。
　　 3.将5'端和3'端以及中间片段PO进行拼接,以拼接序列设计引物,成功地从甜菜叶片中首次分离了NiR的全长基因,登录号为HQ224499,长度为2014bp。该序列含有一个长度1830bp的开放读码框(ORF),编码599个氨基酸,经BLAST分析,核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它植物NiR基因具有较高的同源性。
　　 4.运用PCR扩增技术首次克隆了甜菜NiR基因组序列,登录号为HQ419065,测序结果表明,基因组DNA长度为2815bp,含有4个外显子和3个内含子,内含子长度分别为531bp,135bp和269bp;4个外显子长度分别为437bp,355bp,289bp和799bp。
　　 5.采用TopPred在线工具分析了NiR的理化特性,并构建了NiR的系统发育树,结果表明,甜菜NiR为易溶、亲水性强的蛋白,理论等电点pI为7.21,相对分子量为66.88kDa,该蛋白C端存在一个跨膜区。甜菜NiR与菠菜(Spinaciaoleracea)NiR的亲缘关系最近。二级结构预测结果显示,NiR包含29.05％的螺旋,21.04％的延伸链和49.92％的自由卷曲。卷曲结构和螺旋结构是甜菜NiR的二级结构的主体。另外,应用同源建模法进行NiR三维结构的预测,3D结构包括352个H-bonds:21个Helices;30处Strands;66个Turns。
　　 6.分析甜菜NiR基因编码蛋白的结构域,所推导的氨基酸序列具有完整NiR结构,含血红素蛋白β-化合物区域(hemoproteinbeta-component,ferrodoxin-like,Domain:氨基酸133～203,氨基酸392～461),4Fe-4S区域(4Fe-4Sregion,Domain:氨基酸211～371,氨基酸517～580)。甜菜NiR没有信号肽,是非分泌型蛋白。甜菜NiR氨基酸序列的517～533区域的TGCpns Cgqvqva DIGF为NiR的活性位点。
　　 7.实时荧光定量PCR结果显示,在以0、10、20、30、40、50、80和160mmolL-1NO3--N处理72h的试验中,50mmolL-1处理可使甜菜NiR的表达量达到最大:以0、2、4、8、16、32、64和128mmolL-1NH4+-N处理48h的试验表明,8和64mmolL-1处理条件下甜菜NiR表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理48h的试验中,NO3--N和NH4+-N比例为80:20可使甜菜NiR的表达量达到最大;在氮素诱导的基础上,蛋白抑制剂放线菌酮处理9h,随着处理浓度的增大,NiR的表达量逐渐下降;不同浓度NO2-处理的试验中,40mmolL-1处理下NiR的表达量最大;不同浓度NaCl处理下NiR的基因表达无明显的规律。