传染性胰腺坏死病毒VP2抗原表位区间接免疫荧光方法的建立

摘要

传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)是引起传染性胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的病原，IPN是一种以内脏实质器官出血、坏死为主要病理特征的高度接触性、急性传染病。本病对鲑鳟鱼类稚鱼易感，可引起14～70 d稚鱼大面积死亡，致死率高达90％。感染后幸存的鱼可终生带毒，成为潜在的感染源。该病流行范围广，发病和致死率高，是我国及世界各国家鲑鳟幼鱼死亡的重要疫病，给水产养殖业造成巨大经济损失。
　　 本研究利用RT-PCR方法从感染IPNV-ZYX分离株细胞培养液中扩增出IPNV病毒主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(554～1170 bp)，命名为VP2 COE(616 bp)，该序列与GenBank上发表的美国毒株AF342728同源性高达99.8％，只在710位碱基A→T。将获得的VP2 COE基因定向插入pET30a、pET28a、pProEx HTb、pGEX-6p-1、pCold TF五种不同原核表达载体中，以期获得可溶形式表达的重组蛋白。将重组质粒分别转化大肠杆菌(E.coil)，在其中进行了诱导表达，分别获得重组蛋白，经SDS-PAGE鉴定表明前四种表达载体表达的重组蛋白均以包涵体形式表达，其中以pProEx HTb载体表达的重组蛋白表达量最大，占菌体总量的24％。通过Western Blot进一步分析表明pProEx HTb-VP2 COE重组蛋白得到了正确表达，其产物分子量约为30 kDa。故选取pProEx HTb-VP2 COE重组蛋白作为后续研究的对象。同时，经SDS-PAGE分析pCold TF-VP2 COE重组蛋白以可溶形式表达。通过WesternBlot进一步分析表明pCold TF-VP2 COE重组蛋白得到了正确表达，其产物分子量约为78kDa。分别将切胶纯化获得的蛋白利用谷胱甘肽还原系统复性；变性法亲和层析获得蛋白后，尿素梯度透析复性，结果表明采用PBS缓冲液体系，在4℃条件下，pH值为8.0，复性液中尿素梯度变化为6 M、4 M、2 M、1.5 M、1 M、0.5 M、0 M时，蛋白的复性率最高，回收率可以达到30％。将切胶纯化的pProEx HTb-VP2 COE重组蛋白、谷胱甘肽复性的pProExHTb-VP2 COE重组蛋白、变性亲和层析纯化的pProEx HTb-VP2 COE重组蛋白、尿素梯度复性pProEx HTb-VP2 COE重组蛋白、纯化的pCold TF-VP2 COE融合蛋白分别稀释至0.3mg/ml，免疫6～8周龄BALB/c小鼠。产生的抗体经间接ELISA分析，均可与IPNV(ATCCVR-1318)特异反应，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2 COE亲和层析变性纯化血清、抗pProEx HTb-VP2 COE尿素梯度复性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE谷胱甘肽复性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE切胶纯化血清ELISA效价分别为：1:12800、1：1600、1:6400、1:3200、1:1600。同时中和试验表明，五种血清均具有中和IPNV(ATCCVR-1318)的能力，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2 COE亲和层析变性纯化血清、抗pProEx HTb-VP2 COE尿素梯度复性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE谷胱甘肽复性血清、抗pProEx HTb-VP2 COE切胶纯化血清中和效价分别为：1:51.29、1:44.67、1:25.70、1:12.88、1:3.02。以上两项结果表明，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清具有比较好的抗原性。
　　 本文以制备的抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗，通过反应条件的优化，建立检测IPNV抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确立的最佳反直条件为：IPNV(ATCC VR-1318)最佳接种浓度和培养条件是IPNV10-5接种EPC细胞，18℃恒温箱中培养24 h；细胞固定剂为4％的多聚甲醛；抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清最适工作浓度为1:80倍稀释；FITC标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1:200倍稀释。通过以上条件摸索，确立IPNV间接免疫荧光鉴别诊断方法。用建立的IFA检测方法检测，与IHNV-ZYX分离株、IBDV无交叉反应，具有很好的特异性，且多次重复性试验稳定性较好；以相同方法检测IPNV(ATCC VR-1318)，抗pCold TF-VP2 COE融合蛋白血清稀释至1:320时仍可见较明显的特异性荧光，表明该检测方法敏感性好，可用于检测IPNV感染的实验室诊断及IPNV在感染细胞中的定位和动态分布研究。应用本试验建立的间接免疫荧光方法对15份临床疑似患有IPN虹鳟肝组织、脾脏组织进行检测，有14份样品呈阳性，阳性率为93％。显示与RT-PCR方法检测结果一致，说明建立的间接免疫荧光方法准确、可靠，可用于IPNV的检测。