多能性干细胞培养环境和多能性的相关研究

摘要

健康是人类发展历程中永恒的话题，而干细胞为人类疾病治疗开启一扇大门。干细胞是一群具有自我更新能力的细胞群体。根据多能性水平可以将干细胞分为多能性(pluripotent)干细胞，多潜能(multipotent)干细胞和单能性(unipotent)干细胞。多能性干细胞具有向体内各胚层的分化和自我更新的能力，这为将来干细治疗提供了理论可能。不同物种的多能性干细胞有很大的差别，这在分子标记和细胞克隆形态上都有体现。虽然多能性干细胞将来可作为再生医学的材料，但目前面临很多问题:对于灵长类胚胎干细胞的多能性还没有较统一的定论，不能确定啮齿类多能性干细胞的特性及实验能否在非灵长类动物或人上重复;干细胞的治疗尤其是组织器官修复，需要大量的细胞，目前没有快速获得和纯化的稳定系统;多能性干细胞或者分化之后目的细胞的安全性没有得到充分验证。针对以上问题我们进行了以下实验:
　　 (1)通过改变培养条件将人的胚胎干细胞（human embryonic stem cells，human ESCs）状态转换成小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mouse ESCs）的状态，并比较不同状态人胚胎干细胞所具有的不同生物学特征;
　　 (2)建立高效快速的猪诱导多能性干细胞(pig induced pluripotent stem cells，pig iPS cells)培养系统，并使所获得的猪iPS细胞趋近于小鼠胚胎干细胞的状态;
　　 (3)建立临床级别的人胚胎干细胞系，并进行生物安全性的检测;
　　 通过以上实验我们的到了以下结果:
　　 (1)通过对培养体系进行改变和优化（小分子的添加以及基础培养液的改善，命名为LBX培养液），可以将人的胚胎干细胞状态进行改变，使之趋于小鼠胚胎干细胞的状态，对这种转化后的人胚胎干细胞(mouse ESCs like human ESCs，mhESCs)的研究发现，mhESCs细胞可以进行单细胞传代，克隆形态类似小鼠ESCs的克隆，表达小鼠ES细胞的特异性标记SSEA1。更重要的是针对雌性的mhESCs来讲，它的两条X染色体都处于激活的状态，并且这种体系可以将人iPS细胞的诱导效率提高3-5倍。
　　 (2)在猪的iPS细胞诱导方面，我们通过使用同样的LBX培养体系，大大提高了猪iPS细胞的产生效率，使猪iPS细胞的状态趋近与小鼠胚胎干细胞的状态（命名为pips_m细胞），而通常猪iPS细胞克隆形态为扁平状，类似于人的胚胎干细胞状态（命名为pips_h细胞）。并通过对猪的iPS细胞多能性方面的进行深入分析发现不同状态的猪iPS细胞会有不同的基因表达模式，而这种模式可能导致了猪iPS细胞形态不同。pips_m细胞有更好的增殖效率和单细胞克隆形成能力，这个特点可以大大提高猪多能性细胞的电转效率。并且pips_m细胞可以更好的作为供体细胞进行核移植，提高体内和体外克隆胚胎的发育率。并通过进一步实验摸索发现Nr5a2和Tbx3可以提高猪iPS细胞的产生效率，并且可以替代Oct4进行猪iPS细胞的诱导，甚至只用单因子Nr5α2进行猪iPS细胞的诱导。
　　 (3)在进行基础研究的同时，我们也在通过培养体系的摸索开展临床级别干细胞实验，最终我们建立临床级别的胚胎孤雌干细胞系，并且进行了生物安全的各项检测。
　　 这些研究结果表明环境对多能性细胞的状态起着重要的作用，我们的成果增强了对不同物种多能性的理解，并为将来的生产和临床应用提供很好的材料。

目录

论文说明

声明

摘要

1 前言

1．1 细胞的定型

1．2 小鼠胚胎干细胞的研究进展

1．3 重编程的研究进展

1．3．1 核移植技术

1．3．2 诱导多能性干细胞

1．4 人多能性干细胞研究进展

1．5 多能性干细胞的状态

1．5．1 小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的异同

1．5．2 EpiSCs的获得及不同多能性状态之间的相互转换

1．6 临床级别多能性干细胞

1．7 猪多能性干细胞研究进展

1．8 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物和材料

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 常用试剂及配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 病毒包装

2．2．3 iPS细胞的诱导

2．2．4 多能性细胞的鉴定

3 结果与分析

3．1 通过培养体系的优化将人ES细胞转化为小鼠ES细胞样的细胞

3．1．1 摸索优化并确定起作用的培养液

3．1．2 mhES细胞的鉴定分析

3．1．3 mhESCs的多能性状态分析

3．1．4 进一步用此系统进行其他人ES细胞的转换，并进行iPS细胞诱导尝试

3．2 快速诱导具有小鼠ES细胞样的猪iPS细胞

3．2．1 在LBX培养液中可以高效的诱导猪iPS细胞，并且具有多能性

3．2．2 PiPS_m细胞具有正常的多能性

3．2．3 猪iPS细胞的X染色体状态

3．2．4 相对于pips_h细胞，pips_m细胞具有不同的基因表达模式

3．2．5 猪iPS细胞的核移植和转基因实验

3．3 临床级别人孤雌ES细胞建系

3．3．1 临床级别饲养层的准备

3．3．2 临床级别干细胞系的建立

3．3．3 多能性及生物安全性检测

4 讨论

4．1 环境决定细胞的命运

4．1．1 人ES细胞的多能性状态转换

4．1．2 猪iPS细胞的诱导及应用

4．2 多能性干细胞的未来

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间已发表的学术论文