猪胚胎干细胞分离培养与OCT4-eGFP示踪体系细胞筛选

摘要

胚胎干细胞(ESC)是一种多能性细胞，具有自我更新无限增殖的能力，具有向体内各胚层细胞分化的能力。嵌合实验表明，胚胎干细胞具有生殖系嵌合能力，将性状遗传到下一代，这也是胚胎干细胞独有的特性。应用这一特性，可嵌合生成基因修饰动物。基因修饰动物在基础医学的研究，药物实验的研究，疾病的研究有广泛的应用，因此胚胎干细胞在医学研究和动物性状改变研究有很重要的意义。目前，小鼠、大鼠和人胚胎干细胞技术已经成熟，而大动物还没有成熟的胚胎干细胞技术平台。猪是人类疾病的良好动物模型，也是异种器官移植的理想材料。而猪ESC作为研究性状改良、胚胎发育和医学模型的理想工具。因此，探索猪ESC细胞的适宜培养条件非常必要。
　　 本实验首先观察猪早期体外胚胎的形态和测量直径;通过降低孔板液体量提高囊胚贴壁率;比较双因子培养液和四因子培养液对猪ESC分离的影响;以得到的实验数据对分离真正的猪胚胎干细胞进行探讨。为了能直观的观察分离得到的猪ESC克隆的多能性基因表达和优化培养体系，我们利用TALEN介导同源重组，将带有2A肽序列的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因定点插入Oct-4基因第5外显子的终止密码子处，利用内源性Oct4启动子驱动Oct4和eGFP表达，通过克隆技术得到精确模拟内源性Oct4表达的囊胚。已通过筛选获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。经CRE酶处理后，该细胞制备的克隆囊胚在分离猪ESC过程中可借助OCT4-eGFP荧光标记来确定分离得到的pES克隆是否表达Oct4基因，有利于pES多能性鉴定和培养体系的优化。主要的实验方法和实验结果如下:
　　 第一部分我们对猪早期体外胚胎进行形态观察和直径测量。统计数据表明，猪体外早期胚胎的胚龄与直径成正比。同一胎龄的核移植胚胎、孤雌胚胎之间发育不同步，用胎龄对猪早期体外胚胎进行划分是不科学的。孤雌胚胎的贴壁率要高于核移植胚胎(37.1％，22.8％)，降低孔板液体量可以有效的提高体外胚胎的贴壁效率(22.8％，59％)(P＜0.05)。随后用猪体外胚胎进行胚胎干细胞的分离。实验设计两组培养液进行比较:用双因子培养液我们得到了上皮样集落，并传三个代次，但RT-PCR鉴定结果该细胞克隆表达Cdx2基因，并不表达Oct4基因。用四因子培养液分离得到2个小集落，集落传代后不增殖。
　　 第二部分通过剪取猪耳，建立猪耳成纤维细胞系WPF17-1和WPF17-2。耳成纤维细胞药物压力筛选结果显示300μg/mL浓度为筛选的适宜浓度。将构建好的Donor质粒线性化后与TALEN mRNA共同转染WPF17-1和WPF17-2两耳成纤维细胞系，通过新霉素和丙氧鸟苷的正负药物筛选，经过16天的连续筛选，获得细胞克隆13个，经鉴定获得4个阳性克隆。已获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 干细胞概述

1．1．1 胚胎干细胞概述

1．1．2 胚胎干细胞建系进展

1．2 猪胚胎干细胞研究进展

1．3 影响猪ESC建系的因素

1．4 滋养层干细胞研究进展

1．5 Oct4-GFP报告系统

1．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂及配制

2．1．4 实验耗材

2．2 猪胚胎干细胞分离培养

2．2．1 饲养层的准备

2．2．2 猪核移植囊胚的获得

2．2．3 猪孤雌囊胚的获得

2．2．4 猪胚胎干细胞的分离

2．2．5 猪滋养层干细胞样细胞分离培养

2．2．6 猪滋养层干细胞样细胞的分子鉴定

2．3 OCT4-eGFP示踪模型细胞筛选

2．3．1 猪耳成纤维细胞系的建立及培养

2．3．2 猪成纤维细胞筛选压力曲线

2．3．3 TALEN工作效率检测

2．3．4 细胞转染及筛选

2．3．5 24孔板细胞的DNA提取

2．3．6 克隆点的分子鉴定

2．3．7 阳性细胞的保存与复苏

2．4 数据统计分析方法

3 结果与分析

3．1 猪胚胎干细胞分离培养

3．1．1 饲养层细胞

3．1．2 猪早期体外胚胎发育情况的研究结果

3．1．3 体外囊胚贴壁率的提高

3．1．4 不同培养液分离猪ESC的结果

3．1．5 猪滋养层干细胞样细胞分离培养

3．2 OCT4-eGFP示踪体系细胞筛选

3．2．1 猪耳成纤维细胞系建立

3．2．2 猪耳成纤维细胞系对新霉素的压力曲线

3．2．3 TALEN工作效率检测

3．2．4 OCT4-eGFP示踪模型细胞的转染、筛选和鉴定

4 讨论

4．1 囊胚质量对ESC建系的影响

4．2 全胚培养法对ESC建系的影响

4．3 建立真正的猪ESC细胞系

4．4 OCT4-eGFP示踪体系

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文