转BADH基因大豆对盐碱土壤磷素转化的影响

摘要

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因是高等植物合成渗透调节剂甜菜碱的关键基因。将BADH基因导入栽培大豆黑农35培育得到的转BADH基因大豆能够在盐碱土壤中生长正常。转BADH基因大豆田间释放可能对土壤生态系统产生影响，假设BADH基因导入改变了根系分泌物的组成、数量，将导致与磷素转化有关的功能细菌群落结构和多样性发生变化，并影响根际磷素的转化和生态过程。
　　 选择大豆主产区黑龙江省西部盐碱土壤，以转BADH因大豆(SRTS)、受体菲转基因大豆(HN-35)、野生大豆(YS-21)及当地常规栽培品种抗线王(K)和合丰50(HF-50)为研究材料，大田实验与框栽试验相结合，分析根系分泌物的差异，并采用PCR-DGGE相结合的方法，研究SRTS对根际土壤中与磷素转化过程相关的关键功能菌——有机磷细菌(PMB)和无机磷细菌(PSB)多样性的影响，同时测定磷素转化主要生态指标的变化，分析磷细菌变化与磷素转化生态功能改变之间的联系。该研究揭示了BADH基因导入大豆对土壤磷素转化主要生态过程及磷细菌群落结构和功能影响机理，为转BADH基因大豆的土壤生态安全评价提供研究基础。主要结论如下:
　　 1.转BADH基因大豆对根系分泌物组成和数量的影响
　　 SRTS的H+分泌量最多(0.049μmol·g-1 dry root·h-1)，显著的高出K、HN-35、Y-21和HF-5014.65％、48.20％、40.43％和63.16％。相比于其它品种大豆，SRTS具有更强的释放H+的能力，从而可以有效的酸化土壤，调节其生境根际土壤的pH值，改善盐碱环境。
　　 与HN-35相比，SRTS显著改变了根系分泌物中有机酸的种类和数量。SRTS根系分泌物中检测出5种有机酸，HN-35检测出6种有机酸，酒石酸和丙二酸为SRTS根系分泌物中没有的成分，苹果酸是SRTS较HN-35所特有的有机酸成分。柠檬酸为分泌最多的有机酸，SRTS的柠檬酸、乙酸分泌量显著高于其它品种大豆，而SRTS和HN-35草酸和琥珀酸的分泌量差异不显著。从有机酸的总含量来分析，SRTS较其亲本HN-35分泌的有机酸种类少，但是含量显著高于HN-35。
　　 SRTS与其它品种大豆间氨基酸种类变化不大，但是含量上差异较大。18种氨基酸中均检测到13种，其中天冬氨酸是分泌最多的氨基酸。此外，SRTS根系分泌物中谷氨酸、天冬酰胺、色氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的含量均占有很大的优势，分别显著高出其亲本HN-35102.79％、55.43％、34.28％、33.79％、78.17％、63.29％、117.84％和147.62％。SRTS根系分泌物中氨基酸的含量只有丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸较其亲本HN-35少。SRTS的氨基酸总量显著高于HN-35、Y-21和HF-50，并分别高出37.93％、17.63％和131.68％，和K的差异不显著。
　　 SRTS与HN-35、K和HF-50在可溶性总糖含量上没有显著差异，只显著高出Y-2178.52％。碳水化合物的组成及含量，在一定程度上存在差异。在大豆根系分泌物中均检测到了10种碳水化合物成分，包括:肌醇、赤藓糖醇、丙三醇、核糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖和半乳糖。从整体来看，趋势较为一致，核糖醇的分泌量最多，蔗糖的分泌量最少。其中赤藓糖醇、丙三醇、果糖、葡萄糖、阿拉伯糖的含量，SRTS显著高于HN-3518.65％、17.26％、136.06％和13.14％。核糖醇、果糖、葡萄糖和半乳糖的含量二者之间无显著差异，SRTS只有肌醇和麦芽糖的含量显著低于HN-35。
　　 2.转BADH基因大豆对根际土壤磷素有效性的影响
　　 SRTS对根际土壤速效磷存在一定程度的影响，但其影响具有时期性。SRTS在花期和结荚期对根际土壤速效磷有一定的促进作用，鼓粒期SRTS与HN-35、HF-50的差异不显著，却显著高于Y-21及K，分别高出4.32％和11.15％，成熟期SRTS根际土壤速效磷低于HN-35，但却显著高于其它大豆品种。
　　 SRTS对根际土壤有机磷有促进作用，从整个生育期土壤有机磷平均水平来看，SRTS显著高于其它品种大豆。从花期到成熟期，SRTS对土壤有机磷的含量均有一定程度的促进。SRTS对根际土壤无机磷的影响具有时期性，在花期对土壤无机磷的活化能力最强，而其它时期SRTS与其它品种大豆无显著差异。
　　 SRTS对土壤微生物量磷有促进作用，在苗期、结荚期、成熟期SRTS均强于HN-35。SRTS对土壤微生物量碳有促进作用，在苗期、花期、结荚期和成熟期SRTS对根际土壤微生物量碳的促进作用高于同期HN-35。SRTS对土壤微生物量C/P有抑制作用。
　　 3.转BADH基因大豆对根际土壤磷素转化生态功能的影响
　　 SRTS对根际土壤酸性磷酸酶活性的影响表现为大豆苗期、花期和结荚期对酸性磷酸酶活性有促进作用，鼓粒期和成熟期对酸性磷酸酶活性有抑制作用。SRTS对根际土壤中性磷酸酶活性有显著的促进作用，SRTS中性磷酸酶活性较HN-35、Y-21、K和HF-50分别提高了26.42％、203.92％、14.15％和32.94％。SRTS对根际土壤碱性磷酸酶活性影响较小，除鼓粒期外，其它生育期SRTS根际土壤碱性磷酸酶活性与其亲本非转基因大豆HN-35之间的差异均未达到显著水平。通过相关性分析表明，中性磷酸酶活性对磷素有效性的影响最显著。
　　 SRTS能够降低根际土壤pH，它直接影响土壤微生物群落的种类、数量和活性等。SRTS提高了有机磷细菌和无机磷细菌的数量，并显著促进了有机磷转化作用强度和无机磷转化作用强度，相关性分析表明，有机磷细菌数量与有机磷转化作用强度，无机磷细菌数量与无机磷转化作用强度均呈显著正相关关系。
　　 4.转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌群落多样性的影响
　　 SRTS根际土壤有机磷细菌(PMB)的条带数低于HN-35，多样性指数（Dsh）及均匀度指数（Jsh）均要高于其亲本HN-35;SRTS根际土壤无机磷细菌(PSB)的条带数高于HN-35，多样性指数（Dsh）及均匀度指数（Jsh）均要低于其亲本HN-35。主成分分析与Cluster分析结果一致显示，SRTS有机磷细菌和SRTS、HN-35无机磷细菌群落结构相似度较高，与HN-35有机磷细菌差别较大。SRTS的种植抑制了根际土壤中有机磷细菌某些类群的生长（如条带1、m、n、q、u、v、w所代表的PMB类群），也促进了某些类群的生长（如条带a、g、o、p、t所代表的PMB类群）。SRTS的种植抑制了根际土壤中无机磷细菌某些类群的生长（如条带C、K、L所代表的PSB类群），也促进了某些类群的生长（如条带D、F、J、Q、R、S所代表的PSB类群）。根际磷细菌的菌群种类均已在前人文献中记录和归类，本研究中根际有机磷细菌匹配菌株主要属于芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞杆菌（Pseudomonas）、肠细菌（Enterobacter）、黄杆菌（Flavobacterium）、和沙门氏菌（Salmonella），其中黄杆菌和沙门氏菌为SRTS根际有机磷细菌所特有的菌群，SRTS缺失条带属于芽孢杆菌、假单胞杆菌和肠细菌。根际无机磷细菌匹配菌株主要属于芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞杆菌（Pseudomonas）、肠细菌（Enterobacter）、和柠檬酸细菌（Citrobacter），其中柠檬酸细菌为SRTS根际无机磷细菌所特有的菌群，SRTS缺失条带属于芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞杆菌（Pseudomonas）、肠细菌（Enterobacter）。研究结果表明在一定程度上SRTS的种植减少了根际土壤中有机磷细菌群落的多样性，促进了根际土壤中无机磷细菌群落的多样性，改变了磷细菌群落的结构，并且影响了某些磷细菌类群的生长与分布。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 转基因植物应用现状

1．2．2 转基因植物的生态环境风险

1．2．3 转基因大豆的生物安全性评价

1．2．4 根系分泌物的研究

1．2．5 土壤中磷素的循环转化

1．2．6 土壤中解磷菌的研究

1．3 本研究的课题来源及研究内容

1．3．1 本研究的课题来源

1．3．2 本研究的研究内容及技术路线

2 材料与方法

2．1 研究区域概况

2．2 试验材料

2．2．1 供试品种及小区设计

2．2．2 土壤样品采集与处理

2．2．3 根系分泌物的收集

2．3 研究方法

2．3．1 根系分泌物组成及数量的测定

2．3．2 土壤中磷素养分有效性及相关的理化指标测定

2．3．3 土壤中磷素转化相关的生态功能指标测定

2．3．4 解磷细菌多样性的测定

3 结果与分析

3．1 苗期转BADH基因大豆与其它品种大豆根系及地上部形态特征的比较分析

3．1．1 苗期转BADH基因大豆与其它品种大豆根系及地上部生物量积累的差异

3．1．2 苗期转BADH基因大豆与其它品种大豆根系长度、根表面积及根体积的差异

3．2 转BADH基因大豆与其它品种大豆根系分泌物组分的比较分析

3．2．1 转BADH基因大豆与其它品种大豆根系分泌物pH和H+分泌量的差异

3．2．2 转BADH基因大豆与其它品种大豆根系分泌物中有机酸含量的差异

3．2．3 转BADH基因大豆与其它品种大豆根系分泌物中氨基酸含量的差异

3．2．4 转BADH基因大豆与其它品种大豆根系分泌物中可溶性总糖和碳水化合物含量的差异

3．3 转BADH基因大豆对根际土壤磷素养分有效性的影响

3．3．1 转BADH基因大豆对根际土壤速效磷的影响

3．3．2 转BADH基因大豆对根际土壤有机磷和无机磷及pH的影响

3．3．3 转BADH基因大豆对根际土壤微生物量C、P的影响

3．4 转BADH基因大豆对根际土壤磷素转化生态功能的影响

3．4．1 转BADH基因大豆对根际土壤磷酸酶活性的影响

3．4．2 转BADH基因大豆对根际土壤磷转化作用强度的影响

3．5 转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌的影响

3．5．1 转BADH基因大豆对根际土壤有机磷细菌数量的影响

3．5．2 转BADH基因大豆对根际土壤无机磷细菌数量的影响

3．6 不同品种大豆根际土壤磷素转化指标的相关性分析

3．6．1 速磷与磷素转化相关指标的关系

3．6．2 有机磷与磷素转化相关指标的关系

3．6．3 无机磷与磷素转化相关指标的关系

3．6．4 微生物量P与磷素转化相关指标的关系

3．7 转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌多样性的影响

3．7．1 磷细菌菌液的提取分离

3．7．2 DNA提取

3．7．3 磷细菌的PCR图谱

3．7．4 转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌群落多样性的影响

4 讨论

4．1 转BADH基因大豆根系形态及生物量对磷素转化的影响

4．2 转BADH基因大豆根系分泌物中pH和H+释放量对磷素转化的影响

4．3 转BADH基因大豆根系分泌物中有机酸、氨基酸和碳水化合物组分对磷素转化的影响

4．4 转BADH基因大豆对根际土壤磷素有效性的影响

4．4．1 转BADH基因大豆对根际土壤速效磷的影响

4．4．2 转BADH基因大豆对根际土壤pH的影响

4．4．3 转BADH基因大豆对根际土壤有机磷、无机磷的影响

4．4．4 转BADH基因大豆对根际土壤微生物量C、P的影响

4．5 转BADH基因大豆对根际土壤磷素转化生态功能的影响

4．6 转基因作物对土壤功能性微生物多样性的影响

4．7 转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌多样性的影响

5 结论

5．1 转BADH基因大豆根系分泌物组成和数量的变化

5．2 转BADH基因大豆对根际土壤磷素有效性的影响

5．3 转BADH基因大豆对根际土壤磷素转化生态功能的影响

5．4 转BADH基因大豆对根际土壤磷细菌群落多样性的影响

6 创新点

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文