猪嵴病毒流行病学调查及CH/HZ/2011株全基因序列分析

摘要

猪嵴病毒(Porcine Kobuvirus，PKV)和其它两个国际官方确认的已知成员:爱知病毒(Aichivirus，AiV)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus，BKV)都属于小RNA病毒科嵴病毒属，但是到目前为止，PKV为待定成员。
　　 急性腹泻可以导致猪的发病死亡，其中病毒是引起猪腹泻的主要病原体之一，常见的有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)等，还有许多新发现的肠道病毒可能与猪的腹泻有关，例如猪嵴病毒。在匈牙利、中国、日本、韩国等国家的健康猪群中，猪嵴病毒广泛存在，已有研究表明，猪腹泻与猪嵴病毒的感染有关。为了研究猪嵴病毒在中国的流行情况，本研究根据GenBank上猪嵴病毒3D基因保守区域核苷酸序列设计了一对特异性引物，并利用RT-PCR方法对2011、2012年期间来自27个省市126个猪场的病料共计448份进行了3D基因的检测，以调查猪嵴病毒PKV的流行情况。结果显示在448份病料中，共有112份为猪嵴病毒阳性，病料阳性率为25.00％，而在检测的126个猪场中，共有51个猪场显示猪嵴病毒阳性，猪场阳性率为40.48％。为了解猪嵴病毒3D基因的遗传变异情况，对2012年分离的9个猪嵴病毒部分3D基因进行扩增、克隆和序列测定，将所得序列与GenBank收录的人、牛、猪以及鼠等毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个猪嵴病毒3D基因与国内外其他猪嵴病毒株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上都具有较高的同源性，表明猪嵴病毒的3D基因具有较高的保守性，可以作为病原检测的靶基因。
　　 为了更准确的了解猪嵴病毒变异及进化特点，我们利用SMARTTM3'-RACE和SMARTTM5'-RACE以及6对引物对CH/HZ/2011毒株的基因组进行了分段扩增与序列测定，在此基础上获得了CH/HZ/2011毒株的全基因组序列（GenBank登录号:JX827598）。使用DNAStar、Mega、Bioedit等生物信息学软件对CH/HZ/2011毒株的全基因组序列进行了遗传进化分析，并进一步对猪嵴病毒的VP1基因进行了生物信息学分析。结果显示CH/HZ/2011株除3'多聚A尾巴全长为8101个碱基，共编码2459个氨基酸。PKV的主要基因和基因组功能片段为5'UTR，结构蛋白VP0、VP3和VP1，非结构蛋白2ABC和3ABCD，以及3'UTR。本研究将CH/HZ/2011全基因组与GenBank上的其他全基因进行了全基因组比较，结果显示CH/HZ/2011的5'末端和2B基因分别缺失18和90个碱基，5'末端18个碱基的缺失是我们这一株所特有的性质。全基因组系统进化树分析显示CH/HZ/2011与HNXX、SH-W和XX同源性较高。随后我们又对CH/HZ/2011的VP1基因和GenBank中泰国、日本和匈牙利的VP1基因进行了系统进化树分析，发现这31个PKV的VP1基因可以分成四个群:Thai-Japanesegroup，Hungarian group，Chinese groupⅠ和Ⅱ，其中CH/HZ/2011位于Chinese groupⅡ中。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 PKV的发现及其生物学分类

1．1．1 PKV的发现

1．1．2 PKV的生物学分类

1．2 PKV的基因组结构与功能

1．2．1 Kobuvirus的基因组结构及其编码的蛋白

1．2．2 PKV基因组结构、编码蛋白及生物学特性

1．3 PKV流行病学

1．3．1 国外kobuvirus流行情况

1．3．2 国内kobuvirus流行病学

1．4 PKV的变异

1．5 Kobuvirus的诊断方法

1．5．1 分离培养

1．5．2 免疫学与血清学方法

1．5．3 电镜技术

1．5．4 分子生物学的方法

1．6 PKV实验室的诊断

1．7 研究目的与意义

2 猪嵴病毒流行病学调查及其3D基因序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 流行病学调查

2．2．2 PKV 3D基因核苷酸序列及推导氨基酸同源性分析

2．3 讨论

3 PKV全基因组测序

3．1 试验材料

3．1．1 样品

3．1．2 主要试剂和试验用溶剂配制

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 引物

3．2 实验方法

3．2．1 病毒RNA提取

3．2．2 cDNA合成

3．2．3 PCR

3．2．4 产物鉴定以及回收

3．2．5 PCR产物连接与转化

3．2．6 重组质粒提取、鉴定及基因序列测定

3．2．7 PKV全基因组序列拼接、分析和序列比对

3．2．8 VP1基因系统进化树分析

3．2．9 参考序列

3．3 结果

3．3．1 结构基因及非结构基因的扩增与克隆

3．3．2 CH／HZ／2011基因组结构组成

3．3．3 CH／HZ／2011 5′ UTR、3′ UTR的分子特征

3．3．4 VP1基因的系统进化分析

3．4 讨论

4 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文