硒蛋白W对鸡肝脏细胞凋亡影响的研究

摘要

硒蛋白W(SelW)是硒蛋白家族一员，在多种动物的不同组织中均有表达，其中肝脏中的表达较多。氧化应激能够引起肝脏的损伤，如肝硬化、脂肪肝、酒精肝等。目前鸡SelW被证明具有抗氧化的作用，然而SelW在中的作用机制仍不清楚。因此本实验在复制缺硒鸡模型与建立体外培养鸡原代肝细胞SelW敲低与过表达模型的基础上，采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术，分别检测SelW、调亡因子（P53、caspase-3、Bax、Bak-1、Bcl-2）mRNA以及炎症因子（cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS、NF-κB）mRNA和细胞因子(IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ)mRNA; Western blot法检测了cox-2、PTGEs、NF-κB、SelW基因蛋白的表达变化量;TUNEL法检测了细胞凋亡的程度，结果表明:
　　 1.本实验成功建立鸡原代肝细胞SelW敲低和过表达模型。成功将pcDNA3.1/SelW转染到肝脏原代细胞中的最适条件是六孔板每孔加入8μL转染试剂和2μg的表达载体;将StealthRNA(S-RNA)转染到鸡肝脏原代细胞中的最适条件是六孔板每孔加入0.9μL S-RNA+1.5μLRNAiMAX。过表达细胞中SelW的含量比正常组中高2000多倍，敲低组中SelW的表达量为正常组的50％左右。
　　 2.鸡缺硒组中，肝脏P53、caspase-3、Bax、Bak-1 mRNA的表达量增加，而Bcl-2 mRNA的表达随着时间的推移呈现先升高后降低的趋势;在体外，细胞过表达SelW时，P53、caspase-3、Bax、Bak-1 mRNA的表达量比对照组低，而Bcl-2的表达量高，而细胞敲低SelW组中，P53、caspase-3、Bax、Bak-1 mRNA的表达量增加，Bcl-2 mRNA的表达量降低，并且细胞的凋亡率明显低于沉默组。表明SelW能够抑制促凋亡因子的产生，促进抗凋亡因子的表达，从而保护肝脏免受氧化应激导致的凋亡损伤。
　　 3.鸡缺硒组中，肝脏cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS及NF-κB mRNA的表达量比对照组中高，并且cox-2、PTGEs及NF-κB蛋白的表达量也一致;在体外，细胞过表达SelW时，cox-2、PTGEs、TNF-α、iNOS及NF-κB mRNA的表达量比对照组低，并且cox-2、PTGEs、NF-κB蛋白的表达量也降低，而细胞敲低SelW组中，cox-2、PTGEs、TNF-α、 iNOS及NF-κBmRNA的表达量升高，其蛋白检测结果一致。证明SelW能够抑制炎症因子的表达。
　　 4.鸡缺硒组中，肝脏细胞因子IL-1、IL-6、IL-8及IL-17 mRNA的表达量比对照组高，而IL-4和IL-10 mRNA的表达量随着时间的增加呈现降低的趋势，IFN-γ mRNA的表达量是降低的;在体外，细胞过表达SelW时，在鸡肝脏细胞中IL-1、IL-6、IL-8及IL-17的表达量比对照组低，而IL-4和IL-10 mRNA的表达量随着时间的增加呈现升高的趋势，IFN-γ mRNA的表达量是升高的，而细胞敲低SelW组中的结果与缺硒组结果一致。证实鸡SelW能够通过调节细胞因子的表达，提高肝脏免疫功能。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 缺硒对鸡肝脏的影响

1．2 硒蛋白W的抗氧化功能

1．3 肝脏氧化损伤与细胞因子的关系

1．4 肝脏氧化损伤与凋亡因子的关系

1．5 试验的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验的总体设计

2．1．1 体内实验

2．1．2 体外实验

2．2 试验的主要试剂及仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要试剂的配制

2．2．3 主要仪器

2．3 试验方法

2．3．1 鸡肝脏细胞的培养

2．3．2 鸡肝脏细胞的鉴定

2．3．3 肝脏细胞过氧化氢IC50的检测

2．3．4 构建SelW过表达肝脏细胞模型

2．3．5 构建SelW沉默肝脏细胞模型

2．3．6 过氧化氢诱导细胞凋亡的TUNEL检测法

2．3．7 建立肝脏中相关基因mRNA水平检测的实时荧光定量PCR方法

2．3．8 肝脏NF-κB、COX-2、PTGEs及SelW蛋白表达的免疫印记检测法

2．4 试验数据的分析与统计

3 结果与分析

3．1 鸡原代肝脏细胞体外培养及鉴定结果

3．2 肝脏细胞过氧化氢IC50的测定及形态学观察结果

3．3 鸡肝脏原代细胞SelW过表达条件的优化结果

3．4 细胞干扰条件的优化结果

3．5 过氧化氢诱导细胞凋亡的TUNEL法检测结果

3．6 实时定量PCR检测方法的建立的结果

3．7 鸡肝脏细胞转染SelW基因后SelW mRNA的检测结果

3．7．1 鸡肝脏细胞过表达SelW基因后SelW mRNA的检测结果

3．7．2 鸡肝脏细胞沉默SelW基因后SelW mRNA的检测结果

3．8 双氧水处理的过表达与沉默SelW基因后鸡肝脏细胞中炎症及细胞因子mRNA表达的检测结果

3．8．1 双氧水处理的过表达与沉默SelW基因后鸡肝脏细胞中炎症因子mRNA表达的检测结果

3．8．2 双氧水处理的过表达与沉默SelW基因后鸡肝脏细胞中细胞因子mRNA表达的检测结果

3．9 双氧水处理的过表达与沉默SelW基因后鸡肝脏细胞中凋亡因子mRNA表达的检测结果

3．10 双氧水处理的过表达与沉默SelW基因后鸡肝脏细胞中cox-2、PTGE和NF-κB蛋白表达的检测结果

3．11 低硒饲喂鸡肝脏中炎症因子mRNA表达的结果

3．12 低硒饲喂鸡肝脏中凋亡因子mRNA表达的检测结果

3．13 低硒饲喂鸡肝脏中细胞因子mRNA表达的检测结果

3．14 低硒饲喂鸡肝脏中cox-2、PGE2、NF-κB蛋白表达的检测结果

4 讨论

4．1 鸡肝脏原代细胞体外培养与转染优化

4．1．1 鸡肝脏原代细胞体外培养与鉴定

4．1．2 细胞转染条件的优化

4．2 鸡SelW对肝脏中炎症因子表达的影响

4．3 鸡SelW对肝脏中细胞因子表达的影响

4．4 鸡SelW对肝脏中凋亡因子表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文