Arthrobacter sp. DNS10降解酶特性及固定化酶对阿特拉津污染土壤修复研究

摘要

本研究，在分析前期分离的长残留除草剂阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10粗酶液基本特性的基础上，优化并确定降解酶的固定化条件，深入探讨固定化酶对消除土壤中阿特拉津的可行性。以期为合理、有效、安全减少土壤中阿特拉津污染提供理论依据。主要结果如下:
　　 前期研究中所分离得到的阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10的降解酶为诱导型胞内酶。当粗酶液（可溶性蛋白浓度为88μg·mL-1）以1∶10(v∶v)的比例加入到阿特拉津初始浓度为50mg·L-1的磷酸盐缓冲液中时，其在最适条件(45℃，pH=8.0)下反应2h后阿特拉津降解率达到96.23％。降解动力学方程为y=109.38x+280.18，游离酶对底物表现出良好的亲和性，其米氏常数(Km)为2.56mmol·L-1，最大反应速率(Vmax)为3.57×10-3mmol·min-1，上述降解酶的热稳定性和pH稳定性较差，几种典型的金属离子(Ca2+、Mg2+、Mn2+、K+、Na+、Fe2+)对降解酶的降解能力影响较小。
　　 以海藻酸钠为固定化基质对游离态粗酶进行固定化处理，借助SAS软件筛选出海藻酸钠浓度、固定化体系的pH值、粗酶液量和CaCl2溶液质量分数等四个因素作为影响固定化酶活性的主要因素。实验得到的最佳固定化条件为:10mL固定化体系中粗酶液最优添加量为983μL(可溶性蛋白的浓度为88μg·mL-1)，海藻酸钠的质量分数为1.93％，固定化体系的pH值为8.5，CaCl2溶液质量分数为2.7％。
　　 实验所得的固定化酶最适反应温度为50℃，pH为8.0。最适条件下固定化酶的降解动力学方程为y=128.57x+463.13，其Km为3.74mmol·L-1，略大于游离态降解酶的Km值，Vmax为2.16×10-3mmol·min-1。游离酶经过固定化处理后，固定化酶热稳定性和pH稳定性较游离酶相比得到了明显的提高。固定化酶被重复使用3次，其对阿特拉津的降解能力有所下降但是幅度不大。两种形态降解酶的贮存稳定性差异明显（室温和4℃的条件下），游离酶在保存到第21天时，其对底物阿特拉津降解能力基本消失，固定化酶保存到35天时其降解能力的损失率分别为73.90％.和74.67％。
　　 实验室条件下固定化酶(投加率1∶10(m∶m))可以加快土壤中阿特拉津的分解速度。修复28天后，修复处理土壤样品中基本无阿特拉津被检出(阿特拉津的初始浓度为10mg·kg-1)，而污染处理中的阿特拉津残留浓度仍高达5.02mg·kg-1。修复过程中，污染处理的土壤生物量碳指标及土壤呼吸强度与其他两种处理（修复处理和空白处理）相比明显增加，而土壤细菌多样性指数以及均匀度指数下降。修复处理中，固定化酶不仅可以有效的抑制阿特拉津对土壤微生物量碳和呼吸强度的刺激作用，还可以使土壤中细菌多样性指数接近于空白处理。上述结果说明利用本文中所制备的固定化酶不仅可以有效降解阿特拉津，并且具有一定的生态安全性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 三嗪类除草剂阿特拉津的概述

1．1．1 阿特拉津的使用范围及基本理化性质

1．1．2 阿特拉津主要污染特性

1．2 阿特拉津降解的相关研究概述

1．2．1 阿特拉津的非生物降解

1．2．2 阿特拉津的生物降解

1．3 固定化酶技术使用现状

1．3．1 主要的酶固定化方法

1．3．2 固定化酶的应用情况

1．4 污染土壤修复技术生态环境效应评价

1．4．1 土壤质量评价的重要性

1．4．2 污染土壤修复技术生态安全评价的主要微生物学指标

1．5 主要研究内容和意义

1．5．1 主要研究内容

1．5．2 研究意义

1．6 技术路线

2 材料与方法

2．1 材料与仪器

2．1．1 试验所用阿特拉津降解菌

2．1．2 试验所用的药品与试剂

2．1．3 试验所用的仪器设备

2．1．4 培养液组成

2．2 阿特拉津的提取方法

2．2．1 液体中阿特拉津的提取方法

2．2．2 土壤中阿特拉津的提取方法

2．2．3 阿特拉津的气相色谱测定条件

2．2．4 溶液中阿特拉津浓度的计算

2．2．5 土壤中阿特拉津浓度的计算

2．3 可溶性蛋白含量的测定

2．3．1 可溶性蛋白标准曲线的绘制

2．3．2 待测溶液中可溶性蛋白浓度的测定

2．4 菌株DNS10降解酶的定位及诱导性研究

2．4．1 胞内酶的提取

2．4．2 胞外酶的提取

2．4．3 降解酶的定位

2．4．4 降解酶诱导性研究

2．5 菌株DNS10降解酶基本降解特性研究

2．5．1 菌株DNS10降解酶酶促反应最适温度

2．5．2 菌株DNS10降解酶酶促反应最适pH值

2．5．3 最适合条件下降解酶降解阿特拉津的动力学研究

2．5．4 菌株DNS10降解酶热稳定性研究

2．5．5 菌株DNS10降解酶酸碱稳定性研究

2．5．6 金属离子对菌株DNS10降解酶降解能力的影响

2．6 菌株DNS10降解酶的固定化方法研究

2．6．1 包埋剂的选择

2．6．2 影响固定化效果的主要因素的筛选

2．6．3 固定化酶的制备

2．6．4 固定化酶活力的测定

2．6．5 响应面法确定最佳固定化条件

2．7 菌株DNS10固定化酶的物理特性及降解特性研究

2．7．1 固定化酶的物理特性研究

2．7．2 固定化酶酶促反应最适温度

2．7．3 固定化酶酶促反应最适pH值

2．7．4 最适合条件下固定化酶降解阿特拉津的动力学研究

2．7．5 固定化酶的热稳定性研究

2．7．6 固定化酶的酸碱稳定性研究

2．7．7 固定化酶重复利用性研究

2．7．8 固定化降解酶贮存稳定性研究

2．8 固定化酶对阿特拉津污染土壤修复过程的生态安全分析

2．8．1 试验所用的土壤

2．8．2 固定化酶对阿特拉津污染土壤的模拟修复

2．8．3 固定化酶污染土壤过程中土壤生态安全分析

3 结果与分析

3．1 可溶性蛋白标准曲线的绘制

3．2 菌株DNS10降解酶基本特性研究

3．2．1 菌株DNS10降解酶定位

3．2．2 菌株DNS10降解酶的诱导性研究

3．2．3 菌株DNS10降解酶最适反应温度的确定

3．2．4 菌株DNS10降解酶最适反应pH值的确定

3．2．5 典型金属离子对菌株DNS10降解酶降解能力的影响

3．2．6 最适合条件下菌株DNS10降解酶对阿特拉津降解的动力学研究

3．2．7 菌株DNS10降解酶的热稳定性研究

3．2．8 菌株DNS10降解酶酸碱稳定性研究

3．3 菌株DNS10降解酶的固定化方法研究

3．3．1 影响菌株DNS10降解酶固定化效果的典型因素的筛选

3．3．2 响应面法优化菌株DNS10降解酶的固定化条件研究

3．3．3 响应面分析图

3．4 菌株DNS10固定化酶的基本特性

3．4．1 固定化酶的粒径及机械强度

3．4．2 固定化酶最适酶促反应温度的确定

3．4．3 固定化酶最适酶促反应pH值的确定

3．4．5 最适合条件下固定化酶降解阿特拉津的动力学研究

3．4．6 固定化酶的酸碱稳定性研究

3．4．7 固定化酶的热稳定性

3．4．8 固定化酶重复利用性能研究

3．4．9 两种形态酶的贮存稳定性

3．5 固定化酶对阿特拉津污染土壤的修复

3．6 固定化酶污染土壤过程中土壤生态安全分析

3．6．1 土壤微生物量碳测定结果

3．6．2 土壤微生物呼吸强度测定结果

3．6．3 土壤细菌多样性测定结果

4 讨论

4．1 阿特拉津降解酶及其固定化研究

4．2 阿特拉津污染生物修复及修复技术生态安全性分析

4．2．1 阿特拉津污染土壤的生物修复

4．2．2 固定化降解酶修复阿特拉津污染土壤生态安全性分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文