固定化阿特拉津降解酶制备及其土壤修复效果研究

摘要

阿特拉津已被联合国环境规划署UNEP列为28种持久性有毒化学污染物之一，具有致癌、致畸和性激素失衡等生物学与生态学毒性。目前，长残留除草剂阿特拉津为环境及各类生物带来的危害已得到各界的广泛关注。本文以阿特拉津污染黑土为研究对象，以海藻酸钠和聚阴离子纤维素为载体，对阿特拉津降解酶进行固定化处理，在优化游离态阿特拉津降解酶适宜固定化材料的基础上，着力探讨固定化酶基本降解特性及污染土壤修复效果，同时还对固定化酶修复阿特拉津污染土壤的生态安全性进行初步的评价，主要研究结果概括如下:
　　 采用包埋的方法对阿特拉津降解酶进行固定化处理，通过单因素分析试验考察海藻酸钠的浓度、聚阴离子纤维素的浓度、壳聚糖浓度、氯化镍浓度、pH值、载体温度，加酶量和海藻酸钠和聚阴离子纤维素比值等因素对固定化阿特拉津降解酶降解效果的影响，应用SPSS软件的主成分分析，考察各因素对降解率的影响大小，结果表明海藻酸钠浓度、聚阴离子纤维素浓度、pH值和载体温度，对固定化降解酶的降解效果影响较大，通过对上述4种因素的正交试验研究，确定最佳的固定化方案为A3B1C1D3，即海藻酸钠的浓度1.75％，聚阴离子纤维素的浓度1.4％，pH值为7.5，温度为29℃。结合方差和极差分析结果，确定影响固定化降解酶降解效果的主次顺序为海藻酸钠浓度＞聚阴离子纤维素浓度＞载体温度＞pH值。本论文研究的最佳固定化材料组合不仅表现出较好的机械强度，还表现出了良好的韧性，在去掉砝码后，一段时间后能基本恢复原来的状态。扫描电镜的结果证明了本文研究的最佳固定化材料组合具有利于固定生物分子的中孔和能够起到一定限域作用的大孔。
　　 上述固定化酶在实验室模拟条件下对阿特拉津污染土壤具有较好的修复效果(污染土壤中阿特拉津的初始浓度为20 mg·Kg-1)。经过28天的修复处理后，添加固定化酶的修复处理土壤样品中基本无阿特拉津被检出。而未添加固定化酶的污染处理中，阿特拉津在土壤中残留浓度仍高达10.13±0.77mg/kg，说明固定化酶的投加可以加快黑土中阿特拉津的分解速度。
　　 本试验结合修复过程中土壤样品的细菌多样性、呼吸强度及关键土壤酶活性三方面的指标来对上述固定化酶修复阿特拉津污染土壤过程的生态安全性进行初步的评价。结果表明:在试验结束时，AT处理的土壤细菌多样性指数最低为2.01，而未受污染处理的土壤样品中细菌多样性指数为2.27略高于酶+AT处理和固定化酶+AT处理，说明应用降解酶和固定化降解酶能可以在一定程度上减缓阿特拉津对土壤细菌多样性的影响。在整个培养期间固定化酶+AT处理和酶+AT处理和未污染处理的呼吸强度分别从5.68±0.43 mg CO2 g-1 h-1增长到6.50±0.11 mg CO2 g-1 h-1和5.41±0.24 mg CO2 g-1 h-1增长到7.39±0.49 mg CO2 g-1 h-1，都没有AT处理的增幅大，说明阿特拉津对土壤微生物呼吸强度有一定的刺激作用，而修复处理可以有效的减少这种刺激作用。土壤酶结果表明，经过28天的培养，未污染处理土壤的脲酶活性为0.441±0.019mg g-1，低于酶+AT和固定化酶+AT处理，证明了游离酶和固定化酶对土壤脲酶的活性有促进作用。在培养第0-3天，阿特拉津对土壤磷酸酶活性有激活作用，随着培养时间的延长阿特拉津一直对磷酸酶的活性产生抑制作用。第0-3天阿特拉津对土壤蔗糖酶的活性有一定的抑制作用。在第7-28天，所有含有阿特拉津的处理对蔗糖酶的活性先激活后抑制。综上所述，本实验采用的固定化材料及阿特拉津降解酶对土壤微生物活性和土壤多样性无不良影响。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 阿特拉津的基本理化特性及和危害

1．1．1 阿特拉津的基本理化特性

1．1．2 阿特拉津的使用现状

1．1．3 阿特拉津的危害

1．2 阿特拉津的修复方法

1．2．1 阿特拉津非生物降解

1．2．2 阿特拉津的生物修复

1．3 固定化酶技术

1．3．1 酶的固定化方法

1．3．2 固定化酶的优点

1．3．3 固定化酶在环境污染治理中应用现状

1．4 土壤的生态安全评价

1．4．1 土壤微生物多样性

1．4．2 土壤酶的研究

1．4．3 土壤微生物呼吸强度的研究

1．5 研究目的与意义

1．6 本文的主要研究内容

1．7 技术路线图

1．8 课题来源

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试土壤样品

2．1．2 药品与试剂

2．1．3 试验仪器

2．1．4 阿特拉津降解基因特异性表达菌株

2．1．5 游离态阿特拉津降解酶

2．2 阿特拉津的提取及测定

2．2．1 溶液中阿特拉津的提取及测定

2．2．2 土壤中阿特拉津的提取及测定

2．3 固定化阿特拉津降解酶的制备

2．4 阿特拉津降解酶的固定化条件的优化

2．4．1 酶促反应条件

2．4．2 典型影响因素的筛选

2．4．3 固定化材料优化的正交试验

2．5 固定化阿特拉津降解酶的物理性能

2．5．1 固定化材料的机械强度测定

2．5．2 固定化材料表面结构的测定

2．6 固定化酶对阿特拉津污染土壤的修复

2．6．1 阿特拉津污染土壤的配制

2．6．2 试验土壤的含水率测定

2．6．3 盆栽试验

2．7 固定化酶修复阿特拉津污染土壤效果的生态学评价

2．7．1 土壤微生物呼吸强度的测定

2．7．2 修复土壤的生物多样性分析试验

2．7．3 DGGE结果分析

2．8 污染土壤修复期间土壤酶活性的测定方法及计算

2．8．1 修复期间土壤脲酶活性的测定方法及计算

2．8．2 修复期间土壤蔗糖酶活性的测定方法及计算

2．8．3 修复期间磷土壤磷酸酶活性的测定方法及计算

3 结果与分析

3．1 阿特拉津降解酶固定化材料的优化

3．1．1 典型影响因素对固定化阿特拉津降解酶活性的影响

3．1．2 固定化降解酶降解效果影响因素的筛选

3．1．3 固定化材料优化的正交试验

3．2 最佳固定化材料的物理性能

3．2．1 固定化材料的机械强度试验

3．2．2 固定化材料的表面结构

3．3 固定化降解酶修复阿特拉津污染土壤试验

3．3．1 土壤样品含水率的测定结果

3．3．2 污染土壤的修复效果

3．4 固定化酶修复阿特拉津污染土壤效果的生态学评价

3．4．1 土壤微生物呼吸强度的分析

3．4．2 修复土壤的生物多样性分析试验

3．4．3 修复土壤的土壤酶活性的变化分析

4 讨论

4．1 阿特拉津降解酶固定化材料的优化

4．2 阿特拉津污染土壤的生物修复

4．3 固定化酶修复阿特拉津污染土壤的生态安全评价

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文