阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼组织DNA甲基化的影响

摘要

DNA甲基化是已知最早被发现的与基因抑制相关的表观遗传机制。DNA的甲基化修饰参与基因表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、X染色体灭活和细胞记忆等诸多重要生物学过程。通常情况下，甲基化水平同基因表达呈负相关，甲基化程度越高基因表达活性越低，甲基化程度越低基因表达越活跃。DNA甲基化异常在体内起着关键的作用，在这个过程中可能导致基因的不稳定性和疾病的发生。然而，很少有人知道有关农药对鲤鱼DNA甲基化的影响。
　　 阿特拉津（Atrazine）和毒死蜱(Chlorpyrifos)分别是三氮苯类和有机磷类农药，这些农药在农业生产中广泛应用，通过地表干/湿沉降、淋溶、径流等方式进入水体，在影响大型浮游藻类和水生植物的同时，对鱼类等水生动物也具有一定的毒理效应。近年来，因这两种农药使用量大、残留期长、水体环境中检出率高和对动物表现出一定的毒性作用等而受到广泛关注。但二者对水生脊椎动物的毒理学研究刚刚起步，为了丰富其毒理学资料，本文以鲤鱼为供试生物，研究了阿特拉津(4.28、42.8和428μg/L)、毒死蜱（1.16、11.6和116μg/L）以及二者联合亚慢性暴露（1.13、11.3和113μg/L）对鲤鱼DNA甲基化的影响。应用高效液相色谱法(HPLC)检测鲤鱼组织中DNA甲基化水平的变化和采用实时荧光定量PCR方法检测鲤鱼组织中甲基转移酶基因表达(DNMT1、DNMT3/4/5/6/7/8、MBD2)的影响。结果表明:
　　 1)建立了鲤鱼组织DNA总甲基化含量的高效液相色谱检测方法，确立最优的色谱条件:色谱柱为DIKMA SpursilC18-EP(250 mm×4.6 mm，5μm);磷酸调pH至3.5，流动相0.05moL·L-1磷酸二氢钾;紫外检测波长280 nm;上样量20μL，流速为1 mL/min。
　　 2) ATR/CPF/mix引起鲤鱼肝脏、肾脏、鳃、肌肉、脑、心脏、肠道和性腺组织DNA总甲基化水平降低，组织不同其表达降低程度有差异，对性腺组织的DNA总甲基化水平影响最为严重，恢复组与暴露期相比DNA总甲基化有所升高，但仍低于对照组水平。证实ATR/CPF/mix引起DNA甲基化水平降低是其毒理学机制之一。
　　 3) ATR/CPF/mix导致鲤鱼肝脏、肾脏、鳃、肌肉、脑、心脏、肠道和性腺组织DNMT1、DNMT3/4/5/6/7/8基因mRNA水平表达降低，恢复期与暴露期相比mRNA表达水平有所升高，但仍低于对照组水平;MBD2 mRNA水平表达升高，恢复期与暴露期相比mRNA表达水平有所降低，但仍高于对照组水平。表明ATR/CPF/mix通过调节上述基因的表达引起组织DNA甲基化含量降低。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 阿特拉津和毒死蜱的概述

1．2 阿特拉津和毒死蜱毒理学研究

1．2．1 阿特拉津毒理学研究

1．2．2 毒死蜱毒理学研究

1．3 毒物对DNA甲基化的影响

1．3．1 DNA甲基化概述

1．3．2 农药及化学物质对DNA甲基化的影响

1．3．3 重金属中毒对DNA甲基化的影响

1．4 研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验毒物

2．2 试验鱼的驯养及暴露环境

2．3 试验的设计

2．3．1 暴露试验

2．3．2 恢复试验

2．4 样品的采集与处理

2．5 主要仪器和试剂

2．5．1 主要仪器

2．5．2 主要化学与生物试剂

2．5．3 主要试剂的配置

2．6 组织DNA总甲基化水平检测

2．6．1 组织DNA提取(酚-氯仿法)

2．6．2 DNA的水解

2．6．3 高效液相色谱条件优化

2．6．4 标准曲线的绘制

2．6．5 回收率与精密度试验

2．6．6 样品的DNA总甲基化水平高效液相色谱法检测

2．7 鲤鱼DNMT1、DNMTs和MBD2基因mRNA表达的检测

2．7．1 引物设计与合成

2．7．2 组织总RNA的抽提

2．7．3 反转录反应

2．7．4 实时PCR扩增

2．8 试验数据的分析与统计

3 结果与分析

3．1 基因组DNA甲基化HPLC检测方法的建立

3．1．1 实验条件的优化结果

3．1．2 二元一次方程和标准曲线的建立

3．1．3 精密度与回收率的测定

3．2 基因组DNA甲基化HPLC检测样品结果

3．2．1 基因组DNA提取结果

3．2．2 样品色谱图

3．2．3 样品DNA甲基化检测结果

3．3 目的基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

3．3．1 组织RNA提取结果的鉴定

3．4 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．1 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼肝脏组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．2 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼肾脏组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．3 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼鳃组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．4 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼肌肉组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．5 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼脑组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．6 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼心脏组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．7 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼肠道组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

3．4．8 阿特拉津和毒死蜱单一及联合暴露对鲤鱼性腺组织DNMT1、DNMT3和MBD2 mRNA表达影响的检测结果

4 讨论

4．1 DNA总甲基化水平检测方法的建立

4．2 阿特拉津和毒死蜱对鲤鱼组织DNA总甲基化水平的影响

4．3 阿特拉津和毒死蜱对鲤鱼组织DNMT1、DNMT3和MBD2基因mRNA表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士期间发表学术论文