FGF-21在抵抗素引发胰岛素抵抗的肝细胞模型中的糖代谢作用

摘要

随着人们生活水平的不断提高，糖尿病逐渐发展成为全球性疾病，严重影响人类健康。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素敏感性降低，是2型糖尿病发生发展的重要机制，与多种代谢异常有关。肝脏作为人体内重要的血糖调控器官，也是发生胰岛素抵抗的主要器官。解决胰岛素抵抗时期机体的糖代谢紊乱一直是糖尿病研究的热点。但胰岛素抵抗的具体诱导因素与发病机制还不是很清楚，抵抗素是2001年Steppan等发现的一种与胰岛素抵抗有密切联系的细胞因子，研究表明，抵抗素作用于肝脏，促进糖异生关键酶表达和肝糖原分解，使肝糖输出增加，从而参与肝脏胰岛素抵抗的形成，进而进一步削弱胰岛素对机体血糖的调控能力。FGF-21是人体内一个重要的糖代谢调节因子，肝脏是FGF-21发挥生物学活性的重要靶器官，高浓度胰岛素刺激而导致的胰岛素抵抗的细胞仍能对FGF-21做出有效应答，FGF21在抵抗素引起的胰岛素抵抗状态下是否仍然具有调节糖代谢作用尚无报道。
　　 本研究的目的是通过构建过表达人抵抗素的胰岛素抵抗肝细胞模型，检测FGF-21在抵抗素过表达引发胰岛素抵抗的肝细胞中的糖代谢作用。本研究构建人抵抗素真核表达载体，转染HepG2细胞，利用流式细胞仪筛选出过表达抵抗素的HepG2模型细胞，分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21刺激细胞，用GOD-POD法检测细胞的葡萄糖摄取情况，利用实时荧光定量PCR方法检测抵抗素转染后及FGF-21处理后细胞GLUT1、PPAR-γ mRNA表达的变化。利用葸酮法检测FGF-21处理后细胞的糖原合成量变化。
　　 本研究成功构建过表达抵抗素的HepG2模型细胞，GOD-POD法检测结果显示，模型细胞经不同浓度胰岛素刺激后，葡萄糖消耗增加比率显著低于对照组，说明模型细胞对胰岛素敏感性降低，产生胰岛素抵抗，但经不同浓度FGF-21刺激后，模型细胞的葡萄糖消耗增加比率与对照组无差异，且葡萄糖消耗比率与FGF-21呈现剂量依赖关系，此结果说明FGF-21可有效调节胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖摄取;实时荧光定量PCR方法检测发现，抵抗素转染后HepG2细胞GLUT1mRNA表达增加，经FGF-21刺激后模型细胞与对照细胞相比GLUT1mRNA的表达仍有上升趋势， PPAR-γ的变化不显著，结果表明FGF-21能有效调节过表达抵抗素引发胰岛素抵抗模型细胞GLUT1表达量，从而促进细胞摄取葡萄糖，有效调节细胞的葡萄糖代谢;利用葸酮法检测糖原合成量，结果表明模型细胞的糖原合成量显著低于对照组，但经不同浓度FGF-21刺激后，糖原合成含量提高，且与FGF-21含量成剂量依赖关系，实验证明FGF-21可增加模型细胞内糖原含量，从而促进细胞对葡萄糖的利用消耗。
　　 综上所述，本研究证明抵抗素过表达的肝细胞，对胰岛素敏感性降低，产生胰岛素抵抗，但FGF-21仍能有效调节其葡萄糖代谢。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 抵抗素的简介

1．1．1 抵抗素的概述

1．1．2 人抵抗素的分子结构特征

1．1．3 人抵抗素的表达与分布

1．1．4 抵抗素与胰岛素抵抗的关系

1．2 FGF-21的简介

1．2．1 FGF-21的概述

1．2．2 FGF-21生物学功能

1．2．3 FGF-21的安全性

1．3 研究目的与意义

2 实验材料

2．1 质粒和细胞株

2．2 培养基及试剂

2．3 Overlap PCR引物

2．4 Real-time PCR引物及试剂盒

2．5 主要仪器设备

3 方法

3．1 Resistin基因定点突变

3．1．1 Resistin基因A段PCR扩增及胶回收

3．1．2 Resistin基因B段PCR扩增及胶回收

3．1．3 Resistin基因Overlap PCR扩增及胶回收

3．1．4 Resistin Overlap PCR纯化产物与T载体的连接

3．1．5 大肠杆菌E．coli DH5 α感受态细胞的制备

3．1．6 连接产物的转化及质粒提取

3．1．7 阳性重组质粒的鉴定

3．1．8 Resistin基因定点突变后的序列测定及分析

3．2 Resistin真核表达载体的构建

3．2．1 Peedual-Resistin真核表达载体设计方案

3．2．2 Pkappa-Resistin重组质粒的构建及鉴定

3．2．3 Pee12．4-Resistin重组载体的构建及鉴定

3．2．4 Peedual-Resistin真核表达载体的构建及鉴定

3．2．5 peedual对照载体构建及鉴定

3．2．6 去内毒素的质粒提取及浓度测定

3．3 过表达抵抗素模型细胞的建立

3．3．1 HepG2细胞培养

3．3．2 细胞转染

3．3．3 阳性细胞的筛选

3．3．4 过表达抵抗素细胞系HepG2-R的鉴定

3．4 过表达抵抗素细胞系HepG2-R糖代谢的研究

3．4．1 MTT法检测Resistin基因转染对HepG2细胞增殖活力的影响

3．4．2 过表达抵抗素细胞系HepG2-R基础糖吸收的检测

3．4．3 过表达抵抗素细胞系HepG2-R对胰岛素敏感性的检测

3．4．4 FGF-21对过表达抵抗素细胞系HepG2-R糖吸收的影响

3．4．5 Resistin基因转染对HepG2细胞GLUT1、PPAR-γ表达的影响

3．4．6 FGF-21对HepG2-R的GLUT1、PPAR-γ表达的影响

3．4．7 Resistin基因转染对HepG2细胞糖原合成的影响

3．4．8 FGF-21对HepG2-R糖原合成的影响

4 实验结果

4．1 Resistin基因定点

4．1．1 Resistin基因A段PCR扩增及纯化

4．1．2 Resistin基因B段PCR扩增及纯化

4．1．3 Resistin基因Overlap PCR扩增及纯化

4．1．4 pMD18-T-Resistin重组质粒的构建及鉴定

4．2 Resistin真核表达载体的构建

4．2．1 Pkappa-Resistin质粒的构建及鉴定

4．2．2 Pee12．4-Resistin重组载体的构建及鉴定

4．2．3 Peedual-Resistin真核表达载体的构建及鉴定

4．2．4 peedual对照载体构建

4．2．5 去内毒素的质粒提取及浓度测定

4．3 过表达抵抗素细胞系HepG2-R建立

4．3．1 细胞转染

4．3．2 阳性细胞的筛选

4．3．3 过表达抵抗素细胞系HepG2-R的鉴定

4．4 FGF-21对过表达抵抗素细胞系HepG2-R糖代谢作用的研究

4．4．1 MTT法检测转染对HepG2细胞增殖的影响

4．4．2 过表达抵抗素细胞系HepG2-R基础糖吸收的检测

4．4．3 过表达抵抗素细胞系HepG2-R对胰岛素敏感性的检测

4．4．4 FGF-21对模型细胞糖吸收的影响

4．4．5 Resistin基因转染对HepG2细胞GLUT1、PPAR-γ表达的影响

4．4．6 FGF-21对模型细胞GLUT1、PPAR-Y表达的影响

4．4．7 Resistin基因转染对HepG2细胞糖原合成的影响

4．4．8 FGF-21对过表达抵抗素模型细胞糖原合成的影响

5 讨论

5．1 过表达抵抗素引发胰岛素抵抗模型细胞的建立

5．2 FGF-21有效调节模型细胞的葡萄糖消耗

5．3 Resistin基因转染对HepG2细胞GLUT1、PPAR-γ表达的影响

5．4 FGF-21对模型细胞GLUT1、PPAR-γ表达的影响

5．5 FGF-21调节模型细胞的糖原合成

6 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文