大豆GmGBP1基因参与光周期开花途径和逆境反应的功能分析

摘要

大豆是一种重要的粮食作物和油料作物，也是人类的主要食用蛋白和工业原料的来源。根据国家粮油信息中心统计，2012年我国大豆播种面积为675万公顷，较上年减少14.43％，大豆产量为1280万吨，较上年减少11.63％。2012年全年我国大豆进口量达到5838万吨左右，再创历史新高，较2011年的5263万吨增长10.92％，我国大豆对外依存度进一步提升。而2011年，中国大豆产量为1449万吨，对外依存度高达78.4％。我国大豆竞争力不强与我国大豆品质差、持续生产力不稳、单产低密切相关。
　　 广适性、逆境胁迫等因素一直是困扰我国大豆生产的主要问题。大豆的生长发育多数对光周期反应是非常敏感的，这一特点严重影响了大豆品种的跨区种植以及适应性，进而影响大豆的产量。生物和非生物逆境是影响植物生长发育的重要限制性因素。高温、低温、干旱和盐碱等非生物逆境胁迫严重影响作物的生长，造成作物的大幅度减产，亚洲地区每年由于非生物逆境造成大豆减产30～50％，严重影响了大豆的产量和品质，威胁着大豆生产。因此，如果要从根本上解决我国大豆生产力低下的被动局面，关键的是要打破大豆生长区域的限制，即改变大豆对光的敏感性，提高大豆品种的适应性，扩大单一大豆品种的种植范围，使大豆品种在不同区域都可以正常的开花、成熟，同时增强大豆对逆境的抗性，改善大豆对环境的适应性，以期扩大大豆的种植面积，使大豆在不同环境下都能高产、稳产。
　　 SKIP是真核生物中的转录共激活子，在转录和剪切中发挥保守的共激活的作用，所有的已发现的SKIP同源蛋白均包含具有S-N-W-K-N信号肽的SNW/SKIP的结构域。对拟南芥和水稻中的SKIP的研究发现，SKIP的表达受多种激素与逆境胁迫的诱导，在植物的高盐和干旱胁迫中起着积极的调节作用，SKIP能够调节细胞活力，维持植物的正常的生长发育，SKIP还参与植物成花诱导，调控植物的开花时间。
　　 为获得具有光周期敏感性降低、抗逆性增强等复合优良性状的大豆基因，本研究利用Real-time RT-PCR方法分析了大豆SKIP同源基因GmGBP1的时空表达模式，及不同日长处理、胁迫和外源激素处理下GmGBP1的表达模式，利用酵母双杂交分析了GmGBP1与GmGAMYB1的蛋白互作情况，通过GmGBP1在模式植物拟南芥以及拟南芥突变体中过量表达，以及利用RNAi方法对拟南芥内源SKIP基因进行沉默，对转基因后代的表型和生理活动分析，了解大豆GmGBP1基因在植物中的基本功能，主要结果如下:
　　 1.大豆中SKIP基因有两个拷贝，分别为位于16号染色体的GmGBP1和位于1号染色体的GmGBP2，GmGBP1和GmGBP2的氨基酸同源率高达96.73％。GmGBP1 cDNA全序列为2253bp，无内含子，编码612个氨基酸，理论等电点(pI)8.69，估计分子量69098.8Da，为亲水性蛋白。GmGBP1蛋白在其190-350个氨基酸处编码一个SKIP/SNW结构域，该结构域包含S-N-W-K-N的信号肽。
　　 2.Real-time RT-PCR分析GmGBP1在大豆根、真叶、三出复叶、茎、花芽、豆荚、幼胚中均有表达，长日照下，GmGBP1在大豆的幼胚、茎和根中表达量较高;短日照下，GmGBP1在大豆的三出复叶、幼胚和花芽中表达量较高，且短日照下GmGBP1除茎外其他部位均比长日照下表达量提高。
　　 3.Real-time RT-PCR分析GmGBP1的表达受GA3和ABA的调控。用100μmol的GA3处理大豆，GmGBP1在2h时达到表达高峰，之后持续上调，受GA3的正调控;用100μmol的ABA处理大豆，GmGBP1在1h时达到表达高峰，之后相对稳定表达，受ABA正调控。
　　 4.Real-time RT-PCR分析GmGBP1的表达受逆境胁迫诱导。用8％的PEG6000模拟干旱处理大豆，GmGBP1在4h时达到表达高峰，呈正调控;用200mM NaC1处理大豆，GmGBP1在4h时达到表达高峰，之后持续上调，呈正调控;用42℃高温处理大豆，GmGBP1在0.5h和1h持续上调并在2h时达到高峰，之后持续上调，呈正调控。
　　 5.构建了GmGBP1原核表达载体pGEX-6p-GmGBP1，重组蛋白产物在包涵体中，大小为95kD。
　　 6.构建了GmGBP1缺失片段酵母表达载体pBD-GmGBP1，转化酵母细胞证实GmGBP1在其C端存在转录激活活性;构建GmGAMYB1缺失片段酵母表达载体pAD-GmGAMYB1，酵母双杂交证实GmGBP1的SKIP结构域与GmGAMYB1的N端蛋白互作。
　　 7.利用pCAMBIA3300-pBI121-GmGBP1载体转化拟南芥，经PPT筛选，PCR和RT-PCR检测获得3个纯合的GmGBP1过表达拟南芥T3代株系;利用pCAMBIA3300-pBI121-GmGBP1载体转化myb33拟南芥突变体，经PPT筛选，PCR和RT-PCR检测获得3个的纯合GmGBP1过表达myb33拟南芥突变体T3代株系;利用pJawoh18-GmGBP1载体转化拟南芥，经PPT筛选，PCR和RT-PCR检测获得3个纯合的atskip干涉拟南芥T3代株系。
　　 8.在长日照下，过表达GmGBP1拟南芥表现早花，过表达GmGBP1的myb33突变体拟南芥花期同野生型，atskip干涉拟南芥为晚花。RT-PCR结果表明，GmGBP1促进CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUST(FT)表达从而促进开花，同时GmGBP1与MYB33结合上调LFY表达促进开花;短日照下，过表达GmGBP1拟南芥和过表达GmGBP1的myb33突变体拟南芥为晚花， atskip干涉拟南芥为早花，RT-PCR结果表明GmGBP1上调FLOWERING LOCUSC(FLC)的表达从而抑制开花。
　　 9.GA3处理转基因拟南芥，可以促进过表达GmGBP1拟南芥种子萌发，对atskip坳干涉拟南芥促进不明显;PAC处理转基因拟南芥，可以抑制过表达GmGBP1拟南芥种子萌发，对atskip干涉拟南芥抑制不明显;ABA处理转基因拟南芥，可以抑制过表达GmGBP1拟南芥和atskip干涉拟南芥种子萌发。
　　 10.GmGBP1降低植物体内ROS清除活性能力，降低盐胁迫相关基因ZAT12，RD26，ZA T7的表达，从而降低植物的盐胁迫耐性;GmGBP1提高植物体内ROS清除活性能力，提高干旱胁迫相关基因MYB2、MYB96、MYC2、RD26、ZAT12的表达，从而提高植物的干旱胁迫耐性;GmGBP1提高植物体内ROS清除活性能力，提高高温胁迫相关基因HSFA16、HSFA2、ZAT7、ZAT12的表达，从而提高植物的高温胁迫耐性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 SKIP基因概述

1．2 大豆光周期现象的研究进展

1．3 植物开花诱导研究进展

1．3．1 光周期途径

1．3．2 春化促进途径

1．3．3 自主途径

1．3．4 赤霉素途径

1．4 植物逆境胁迫研究进展

1．4．1 脱落酸(ABA)的研究进展

1．4．2 ROS清除机制

1．4．3 逆境胁迫相关基因的研究进展

1．5 植物基因功能的研究进展

1．5．1 反向遗传学策略

1．5．2 植物过表达研究

1．5．3 植物基因沉默研究

1．5．4 酵母双杂交技术

1．5．5 基因的定点诱变

1．5．6 插入突变

1．6 本研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 试验材料和试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种及载体

2．1．3 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 Real-time RT-PCR分析GmGBP1的表达

2．2．2 酵母表达载体pBD-GmGBP1和pAD-GmGAMYB1的构建

2．2．3 酵母双杂交分析GmGBP1与GmGAMYB1的相互作用

2．2．4 GmGBP1原核表达研究

2．2．5 拟南芥突变体的筛选

2．2．6 农杆菌介导法侵染拟南芥花序

2．2．7 转基因拟南芥的分子生物学检测

2．2．8 转基因拟南芥的日长处理

2．2．9 转基因拟南芥的激素处理

2．2．10 转基因拟南芥的高盐胁迫处理

2．2．11 转基因拟南芥的干旱胁迫处理

2．2．12 转基因拟南芥的高温胁迫处理

3 结果与分析

3．1 大豆GmGBP基因的序列分析

3．1．1 GmGBP基因的染色体定位

3．1．2 GmGBP基因与其它物种的序列比对

3．1．3 GmGBP基因与其它物种进化树分析

3．1．4 GmGBP基因的序列比对

3．1．5 GmGBP1基因的生物信息学分析

3．2 大豆GmGBP1基因的表达研究

3．2．1 GmGBP1在大豆不同组织器官中的差异表达

3．2．2 大豆叶片中GmGBP1在GA3激素处理下的基因表达

3．2．3 大豆叶片中GmGBP1在ABA激素处理下的基因表达

3．2．4 大豆叶片中GmGBP1在NaCl处理下的基因表达

3．2．5 大豆叶片中GmGBP1在PEG6000处理下的基因表达

3．2．6 大豆叶片中GmGBP1在高温处理下的基因表达

3．3 大豆GmGBP1和GmGAMYB1的蛋白互作研究

3．3．1 酵母表达载体pBD-GmGBP1和pAD-GmGAMYB1的构建

3．3．2 酵母菌株YRG-2的表型鉴定

3．3．3 酵母菌株的组氨酸渗漏表达

3．3．4 GmGBP1的转录自激活活性的鉴定

3．3．5 GmGBP1和GmGAMYB1的蛋白互作分析

3．4 大豆GmGBP1原核表达研究

3．4．1 原核表达载体pGEX-6p-GmGBP1的构建

3．4．2 GmGBP1重组蛋白的表达

3．4．3 GmGBP1重组蛋白的纯化

3．5 拟南芥突变体的鉴定

3．5．1 拟南芥skip突变体SAIL_681_H11的鉴定

3．5．2 拟南芥gamyb突变体SALK_058312的鉴定

3．6 拟南芥的遗传转化及检测

3．6．1 拟南芥的遗传转化

3．6．2 过表达GmGBP1的拟南芥的检测

3．6．3 AtSKIP基因沉默的拟南芥的检测

3．6．4 过表达GmGBP1拟南芥的gamyb突变体的检测

3．7 转基因拟南芥的光周期反应

3．7．1 长日照处理转基因拟南芥

3．7．2 短日照处理转基因拟南芥

3．7．3 暗处理转基因拟南芥

3．8 转基因拟南芥的激素反应

3．8．1 赤霉素处理转基因拟南芥

3．8．2 脱落酸处理转基因拟南芥

3．8．3 多效唑处理转基因拟南芥

3．9 转基因拟南芥的盐胁迫反应

3．9．1 盐胁迫表型分析

3．9．2 盐胁迫生理指标测定

3．9．3 盐胁迫下基因的表达分析

3．10 转基因拟南芥的干旱胁迫反应

3．10．1 干旱胁迫表型分析

3．10．2 干旱胁迫生理指标测定

3．10．3 干旱胁迫下基因的表达分析

3．11 转基因拟南芥的高温胁迫反应

3．11．1 高温胁迫表型分析

3．11．2 高温胁迫生理指标测定

3．11．3 高温胁迫下基因的表达分析

4 讨论

4．1 SKIP基因的序列分析

4．2 SKIP基因在植物生长中的重要作用

4．3 GmGBP1调控植物开花

4．3．1 GmGBP1组织特异性表达

4．3．2 GmGBP1调控植物开花

4．4 GmGBP1改变植物逆境胁迫耐性

4．4．1 GmGBP1基因表达受多种因素调控

4．4．2 GmGBP1降低拟南芥高盐胁迫耐性

4．4．3 GmGBP1提高拟南芥干旱胁迫耐性

4．4．4 GmGBP1提高拟南芥高温胁迫耐性

4．5 SKIP基因在植物中的功能分化

4．6 ROS清除机制在植物逆境胁迫中起关键作用

4．7 酵母双杂交研究植物基因功能

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文