禽流感病毒RT--LAMP系列检测方法的建立和应用

摘要

A型流感病毒属于正粘病毒科，病毒基因组共有8个片段，至少编码11种蛋白。病毒粒子表面囊膜上有血凝素（hemagglut inin，HA）与神经氨酸酶(neuraminidase，NA)两种表面纤突。根据HA与NA的不同可区分为不同的亚型，H有H1～H16，而N有N1～N10。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性。在禽流感的HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）。近年在全球时见报道的主要是H5N1和H7N1亚型以及去年报道的H7N9亚型AIV。比如1997年香港H5N1亚型AIV直接感染人并致死;1999-2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失;2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅导致了重大的经济损失，而且感染89人。去年爆发的H7N9亚型AIV，造成超过300余人感染，50多人死亡。这些事件提示高致病性禽流感不仅会给养禽业造成巨大经济损失，同时还可以跨越宿主屏障直接感染人，严重威胁公共卫生安全。因此，AIV的早期快速诊断和及时监测，对保障全球养禽业的发展和人类健康至关重要。目前，灵敏、特异的分子生物学检测技术，如荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)等方法已经在禽流感的病毒检测中发挥着重要作用，但这些方法都需要复杂的仪器设备（如PCR仪、荧光显微镜等）和具有一定操作技能的实验室人员，在一些基层的实验室使用时受到限制。如何能够针对最先接触疫情的基层实验室，不需要昂贵的仪器就能在现地养殖场进行快速、准确的检测，是迫切需要解决的实际问题。恒温条件下即能进行反应的环介导恒等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测技术应运而生。与传统的PCR和荧光定量PCR相比，LAMP不需要昂贵的仪器设备，具有简便、快速、灵敏、特异的特点，尤其适合在基层和现地开展病原微生物的早期诊断和筛查。 本研究的目的是通过设计针对特异识别AIV的M、HA、NA基因序列中6个不同区段的LAMP引物，建立一系列能够快速便捷地检测A型禽流感病毒的有效方法。 主要包括以下研究内容: 1、A型通用型AIV RT-LAMP检测方法的建立 根据GenBank中登录的A型禽流感病毒(AIV)(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))的基质蛋白M基因序列，设计了一套特异识别M基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一种基于RT-LAMP技术的A型禽流感病毒诊断方法。结果显示，该方法能检测不同亚型的AIVs，且扩增反应可在30 min内完成，对各型AIVs的最小检测限为0.01 PFU的病毒含量，敏感性是常规RT-PCR方法的100倍。若在反应体系中添加Fluorescent Detection Reagent（核黄绿素）染料后，可通过肉眼观察有无特异的绿色荧光来直接判定结果。该方法仅需一个恒温水浴锅就可完成扩增反应，非常适合现地及临床AIV病原的诊断和疫情监测。 2、H9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 根据H9亚型禽流感病毒(A/Chicken/HuNan/33/2008(H9N2))血凝素基因序列，设计了一套特异识别HA基因序列的LAMP引物，并以此套引物建立了检测H9亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示，该方法能特异的检测H9亚型AIV，全部反应可在30min内完成，对H9亚型AIV的最小检测限为0.01 PFU的病毒含量，灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍;对近年来分离到的6株H9N2亚型AIV的检测，该方法能对其进行良好的检测;通过对人工感染棉拭子样品的检测，发现RT-LAMP和病毒分离方法可从第1d即可检测到病毒，而常规RT-PCR方法到第3d才能检测到病毒，进一步证明H9亚型AIVRT-LAMP方法的敏感性好，利于H9亚型AIV的早期诊断。 3、H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 根据H5亚型禽流感病毒(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))血凝素基因序列，设计了一套特异识别H5亚型AIV HA基因的LAMP引物，并以此套引物建立了用于检测H5亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示，方法能特异的检测H5亚型AIV，与其他亚型流感病毒及常见禽病病原无非特异性反应，该方法对H5亚型AIV的最小检测限为0.1 PFU的病毒含量，灵敏度高于普通一步法RT-PCR10倍，全部反应可在30 min内完成。通过对不同宿主来源的H5亚型AIV分离株的检测表明，该方法能够特异性地检测禽源、鸭源和猪源的H5亚型AIV。 4、H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 根据H7亚型禽流感病毒(A/Chicken/HeB/2/2002(H7N2))血凝素基因序列，设计了一套特异识别H7亚型AIV HA基因序列的LAMP引物，并以此套引物建立了检测H7亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示，该方法能特异的检测H7亚型AIV，与其他亚型流感病毒无非特异性反应。通过对H7亚型AIV不同致病力毒株的检测表明，该方法对LPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.01 PFU的病毒含量;对HPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.1 PFU的病毒含量;对不同来源的H7N9病毒的最低检测限为0.01 PFU的病毒含量。这些结果表明，该方法可特异性地检测低致病性和高致病性H7亚型AIV以及新出现的H7N9流感病毒。此外，通过人工感染实验样品检测表明，RT-LAMP方法和病毒分离都能够在病毒感染后第1d检测到排毒，而一步法RT-PCR需要在感染后3d才能检测到排毒，进一步证明该方法的灵敏度高。 针对H7N9流感病毒(A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)) NA基因序列，设计了1套特异识别NA基因序列的RT-LAMP引物，并以此套引物建立了检测N9亚型AIV的RT-LAMP诊断方法。该方法的最小检测限为0.01 PFU的病毒含量，灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍。 从上海和安徽省的活禽市场、养殖场和野鸟栖息地采集了大量的临床样品（包括饮水、土壤、泄殖腔拭子、喉拭子样品），检测结果表明，H7N9 RT-LAMP方法可在30 min内完成样品检测，而且能够有效的从不同来源样品中检测到H7N9流感病毒，进一步证明该方法的可靠性和实用性。 LAMP方法不需要昂贵的特殊仪器设备，反应结果可用肉眼直接观察，非常适合在基层开展病原微生物的早期诊断和筛查。本研究建立的AIV系列RT-LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、简便快速、实用的优点，不仅为禽流感病毒的诊断、监测、早期预警提供了技术保障，而且也为禽流感的有效防控提供技术支撑。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的和意义

1．2 文献综述

1．2．1 禽流感分子生物学研究进展

1．2．2 禽流感公共卫生意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验毒株

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 细胞、菌株、载体

2．1．5 实验动物

2．1．6 临床样品

2．2 试验方法

2．2．1 RNA的提取

2．2．2 MDCK细胞的培养

2．2．3 AIV尿囊液病毒扩增和细胞噬斑测定

2．2．4 RT-LAMP扩增体系条件的优化

2．2．5 特异性试验

2．2．6 敏感性试验

2．2．7 RT-PGR试验方法及其引物序列

2．2．8 病毒分离

2．2．9 动物人工感染实验

2．2．10 人工感染试验样品和临床样品的采集与处理

3 结果与分析

3．1 AIV尿囊液病毒扩增和细胞噬斑测定结果

3．2 禽流感病毒A型LAMP快速检测方法的建立及评估

3．2．1 引物设计

3．2．2 RT-LAMP扩增体系条件的建立

3．2．3 特异性试验结果

3．2．4 敏感性试验结果

3．2．5 已知AIV分离毒株的检测

3．2．6 人工感染试验样品的检测

3．3 H9亚型AIV LAMP快速检测方法的建立及评估

3．3．1 引物设计

3．3．2 H9-RT-LAMP扩增体系和条件

3．3．3 Hg-RT-LAMP特异性试验结果

3．3．4 H9亚型AIV LAMP的敏感性试验结果

3．3．5 H9 AIV LAMP人工感染棉拭子样品的检测结果

3．4 H5亚型AIV LAMP快速检测方法的建立及评估

3．4．1 引物设计

3．4．2 RT-LAMP扩增体系和条件

3．4．3 H5型AIV RT-LAMP的特异性试验结果

3．4．4 H5亚型AIV LAMP的敏感性试验结果

3．4．5 H5 AIV LAMP对不同宿主来源的H5 AIV分离株检测结果

3．5 H7N9亚型AIV RT-LAMP快速检测方法的建立及评估

3．5．1 引物设计

3．5．2 H7-RT-LAMP扩增体系条件的优化建立

3．5．3 H7亚型AIV LAMP的特异性试验结果

3．5．4 H7亚型AIV强弱毒株敏感性的试验结果

3．5．5 H7亚型RT-LAMP对H7N9 AIV不同来源分离株的检测结果

3．5．6 H7亚型AIV LAMP人工感染祥品检测结果

3．5．7 N9亚型RT-LAMP扩增体系条件的优化确定

3．5．8 N9亚型RT-LAMP的特异性试验结果

3．5．9 N9亚型RT-LAMP敏感性的试验结果

3．5．10 H7N9亚型RT-LAMP对H7N9病料及样品检测的试验结果

4 讨论

4．1 A型AIV RT-LAMP检测方法的研究

4．2 H9亚型RT-LAMP检测方法的研究

4．3 H5亚型RT-LAMP检测方法的研究

4．4 H7N9亚型RT-LAMP检测方法的研究

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文