枯草芽孢杆菌菌体对RV感染IPEC--J2细胞TLRs和细胞因子mRNA表达的影响

摘要

益生菌具有治疗肠炎、腹泻、改善动物生长性能、免疫调节等作用而受到广泛关注，但是有关益生菌抗病毒作用机制研究很少。轮状病毒(Roavirus，RV)是引起婴幼儿和仔猪腹泻的重要病原体，主要感染成熟的小肠绒毛上皮细胞，严重威胁人类健康和养殖业的发展。为了研究益生菌-宿主-病毒之间的相互作用关系，本试验采用分离的具有抗RV活性的枯草芽孢杆菌，研究其是否通过激活肠上皮细胞TLRs表达和增加细胞因子分泌，发挥益生菌的免疫调节作用，从而启动抗病毒反应。主要的研究内容和结果如下: 对本实验室从猪的胃肠道已分离、保存的59株益生菌，运用MTT的方法筛选其中具有抗RV活性的菌株。选择一株抗RV活性最高的菌株，经生化鉴定、16sRNA鉴定为枯草芽孢杆菌。 由于猪小肠上皮细胞是轮状病毒感染仔猪的主要靶细胞，所以，本试验选择猪小肠上皮细胞(Porcine intestinal epithelial cells，IPEC-J2)，在体外建立RV感染肠上皮细胞模型和枯草芽孢杆菌菌体预处理肠上皮细胞的情况下感染RV，通过在不同时间点检测病毒液的TCID50，研究RV在肠上皮细胞的增殖曲线和枯草芽孢杆菌菌体预处理细胞时对RV的抑制作用。试验结果显示，初始24 h RV在细胞中增殖缓慢，24 h到48 h病毒迅速增殖，病毒滴度达到峰值，48 h以后病毒滴度开始缓慢下降。枯草芽孢杆菌菌体预处理细胞病毒的增殖有相似的趋势，但是病毒的滴度较低。 将铺满单层的IPEC-J2细胞进行分组处理，分为正常细胞对照组、RV感染组、枯草芽孢杆菌菌体预处理后感染RV组、枯草芽孢杆菌组和大肠杆菌组。然后分别在1h、3h、6h、12 h、24 h、48 h收集细胞样品，荧光定量PCR检测不同时间点各组细胞中IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3、TLR9 mRNA表达量的变化。统计分析数据，在作用细胞初期，RV、枯草芽孢杆菌菌体、枯草芽孢杆菌预处理细胞感染RV均能刺激IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3、TLR9 mRNA表达量增多，6h后大多数处理组细胞因子和TLRs mRNA表达量趋于正常水平，无明显变化。大肠杆菌处理组TLR9和细胞因子mRNA在初期表达增高。 综上所述，枯草芽孢杆菌可以抑制RV在肠上皮细胞中的复制和增殖。RV感染肠上皮细胞的潜伏期大约为24 h，之后开始迅速增殖。枯草芽孢杆菌、轮状病毒短时作用IPEC-J2细胞初期可以刺激IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3、TLR9 mRNA表达量增多，激活机体的先天免疫反应，增加抗感染能力。枯草芽孢杆菌预处理细胞再感染病毒组也可以刺激以上基因表达增多，且呈现叠加效应。推测，枯草芽孢杆菌表现出通过增加肠上皮细胞表面TLRs的表达，激活NF-κB途径，增加部分Th1细胞因子的分泌，调节宿主细胞的非特异性免疫反应，增强对病毒的抵抗力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 益生菌的概述

1．1．1 益生菌的概念及分类

1．1．2 益生菌的作用机制

1．1．3 益生菌抗病毒的相关研究

1．1．4 枯草芽孢杆菌的抗病毒作用

1．2 轮状病毒的概述

1．2．1 RV的病原学特征

1．2．2 RV的临床表现与致病机制

1．2．3 RV的防治现状

1．3 肠黏膜的概述

1．3．1 肠黏膜屏障的构成和功能

1．3．2 肠黏膜的先天性免疫应答

1．3．3 益生菌调节动物的肠黏膜免疫

1．4 目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 细胞和毒株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液的配置

2．1．5 主要实验仪器

2．2 方法

2．2．1 抗RV菌株的筛选及鉴定

2．2．2 RV生长曲线的制备

2．2．3 RT-PCR检测IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3和TLR9 mRNA表达量的变化

2．2．4 数据处理及分析

3 结果与分析

3．1 抗RV菌株的筛选及鉴定

3．1．1 抗RV菌株的筛选

3．1．2 筛选菌株的16sRNA鉴定

3．1．3 筛选菌株的生化鉴定

3．2 RV的生长曲线

3．3 IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3和TLR9 mRNA表达量的变化

3．3．1 目的基因片段扩增

3．3．2 标准品质粒的构建

3．3．3 IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3和TLR9 mRNA表达量的相对变化

4 讨论

4．1 肠道抗RV益生菌株的筛选

4．2 RV在肠上皮细胞的生长曲线及枯草芽孢杆菌对其生长的抑制

4．3 IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3和TLR9 mRNA表达量变化的分析

4．3．1 IL-6、IL-8和IFN-γ mRNA表达量变化分析

4．3．2 TLR2、TLR3和TLR9 mRNA表达量变化分析

5 结论

致谢

参考文献

附录 IL-6、IL-8、IFN-γ、TLR2、TLR3、TLR9 mRNA表达量相对变化

攻读硕士学位期间发表的学术论文