A群猪轮状病毒VP7蛋白单抗的制备及其抗原表位鉴定

摘要

轮状病毒(RV)，属呼肠孤病毒科轮状病毒属，可以引起多种幼龄动物腹泻。A群猪轮状病毒(PoRV)通常是多种血清型混合感染仔猪，主要引起仔猪厌食、严重腹泻、脱水，严重时导致死亡。同时，也是在培育、繁殖、保存SPF猪工作中的重点监测、控制的病毒性传染病病原。目前，PoRV已在全世界范围内传播，给全球养猪业带来了严重的经济损失。 RV含有11节段dsRNA，编码12种蛋白。VP7是RV的表面结构蛋白，与VP4共同组成病毒粒子的最外层结构，VP7既可以介导病毒入侵脱衣壳，又含有刺激宿主个体产生中和抗体的抗原表位。因此，本研究对PoRV的VP7进行了抗原表位的鉴定，从而为PoRV的检测及抗病毒免疫的研究奠定基础。 本研究利用RT-PCR方法克隆了G5和G11血清型VP7基因，并连接至pMD-18T测序载体进行测序。以测序正确质粒为模板，PCR扩增获得截短的G5-VP7、G11-VP7基因(tVP7，151～936)连接至pGEX-6p-1表达载体，构建质粒为G5-6p-tVP7、G11-6p-tVP7转化至DH5α。测序正确的菌体经IPTG诱导表达， SDS-PAGE分析结果显示:重组蛋白G5-tVP7-GST、G11-tVP7-GST大小为56Ku。两重组蛋白经western blot试验证明均可以和抗PoRV的阳性血清发生反应。 以切胶纯化的G5-tVP7-GST、G11-tVP7-GST重组蛋白，常规免疫BALB/c小鼠。通过常规杂交瘤制备技术获得了3株稳定分泌抗G5-VP7蛋白的杂交瘤细胞和4株稳定分泌抗G11-VP7蛋白的杂交瘤细胞。抗G5-VP7蛋白MAbs A6、G8亚类为IgG2b，H4亚类为IgG1，抗G11-VP7蛋白MAbs4B4、4E6亚类为IgG2b，4C5亚类为IgG1，5G2亚类为IgG2a。间接免疫荧光试验表明MAbs可与在MA104细胞上接种的RV产生免疫荧光。Western blot检测表明，MAbs与RV VP7蛋白反应，不与GST标签反应。其中4B4具有中和活性。 分段表达G11-VP7蛋白，利用Western blot试验初步鉴定MAb4C5的抗原表位区为“Y175QQTDEANKWISMG188”。为精确其抗原表位区，合成了10条长度为15aa的多肽，利用ELISA准确的鉴定了MAb4C5的抗原表位区为“Q175TDEANKWIS186”。通过蛋白序列比对检验“Q175TDEANKWIS186”的保守性，结果表明该表位在不同源的A群RV之间是保守的，在PoRV不同血清型之间也是保守的。 本研究制备了7株VP7蛋白单克隆抗体，并鉴定了一个B细胞抗原表位，为A群PoRV的检测及抗病毒免疫提供了有效信息和研究材料。对于利用SPF猪构建感染动物模型，并开展模型评价、探索致病机制等研究也非常重要。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 PoRV概述

1．1．1 PoRV的病毒形态

1．1．2 PoRV的群分类

1．1．3 PoRV的理化特性

1．1．4 PoRV的培养特性

1．1．5 PoRV的基因组结构

1．1．6 PoRV主要结构蛋白

1．1．7 PoRV主要非结构蛋白

1．1．8 RV复制机制

1．1．9 轮状病毒流行现状

1．1．10 PoRV的诊断

1．1．11 PoRV的预防及控制

1．2 抗原表位研究方法

1．2．1 B细胞抗原表位研究方法概况

1．2．2 T细胞抗原表位研究方法概况

1．3 RV抗原表位研究进展

1．4 研究意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器耗材

2．1．3 主要试剂

2．1．4 引物

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因的克隆

2．2．2 目的蛋白的表达及鉴定

2．2．3 单克隆抗体的制备

2．2．4 单克隆抗抗的鉴定

2．2．5 蛋白的表位鉴定

3 结果与分析

3．1 目的基因的克隆

3．1．1 VP7基因扩增

3．1．2 重组质粒的酶切鉴定

3．1．3 生物学软件分析结果

3．2 重组蛋白的表达及鉴定

3．2．1 重组蛋白的表达

3．2．2 重组蛋白的纯化

3．2．3 重组蛋白的Western blot鉴定

3．3 单克隆抗体的制备

3．3．1 间接ELISA检测方法的建立

3．3．2 杂交瘤细胞株的建立

3．3．3 抗体效价测定及MAb亚类鉴定

3．4 单克隆抗体的鉴定

3．4．1 Western blot鉴定

3．4．2 间接免疫荧光鉴定

3．4．3 MTT中和试验结果

3．5 抗原表位的鉴定

3．5．1 蛋白特性分析

3．5．2 分段蛋白的表达

3．5．3 Western-blot鉴定抗原表位

3．5．4 ELISA筛选抗原表位

3．5．5 抗原表位保守性分析

4 讨论

4．1 基因的克隆和蛋白的表达

4．2 单克隆抗体的制备及其鉴定

4．3 抗原表位的鉴定

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文