猪圆环病毒2型Cap蛋白B细胞线性抗原表位鉴定

摘要

猪圆环病毒(PCV)根据血清型可分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1最早作为一种细胞污染物而被发现，但是该种病毒在猪身上并不致病;但PCV2目前是一种世界公认的重要病原，它可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等多种疾病。PCV2含有2个主要的开放阅读框（ORF）:ORF1和ORF2，其中ORF2编码PCV2唯一的结构蛋白Cap蛋白。Cap蛋白由于可以诱导机体免疫应答，产生特异性抗体，从而使其成为研究PCV2的免疫机理和诊断技术的一个目标。 根据目前已经研究报道显示，Cap蛋白由233～235个氨基酸组成，其中包含多个线性和构象抗原表位，其中有部分是和PCV1共有的抗原表位。本研究基于目前的研究报道对Cap蛋白的抗原表位进行鉴定和分析。 本研究首先构建重组载体pET-Cap，利用原核表达系统表达Cap蛋白。对已经表达的Cap蛋白与之前实验室已有的酵母Cap蛋白进行反应原性比较，酵母表达的Cap蛋白要好于原核表达的Cap蛋白。用酵母表达的Cap蛋白作为抗原对BALB/c雌鼠进行免疫制备单克隆抗体获得3株杂交瘤细胞株，命名为1E7、4E2、5D1，其中1E7和4E2可分泌抗Cap蛋白的单克隆抗体，5D1可分泌抗His标签的单克隆抗体。 其次，本研究对Cap蛋白进行截短表达，去除Cap蛋白的核定位信号后，设计引物构建载体表达19个短肽，命名为JD1～JD19。利用肽扫描法，将短肽与单克隆抗体反应，初步鉴定出两个线性抗原表位;再利用该方法对已经鉴定的表位进行进一步的截短，最后确定两株单克隆抗体所识别的精确表位分别为77NDFLPPG83和138YDPYVNY144。在已经定的表位当中77NDFLPPG83与之前文献报道的表位有部分重叠，而138YDPYVNY144之前文献并无报道，为最新发现的表位，补充了关于Cap蛋白抗原表位的分析。 最后，由于单克隆抗体进行间接免疫荧光鉴定时与病毒反应强弱不同，利用生物学软件对已鉴定的抗原表位进行分析，绘制Cap蛋白和PCV2病毒粒子图谱，分析表位在图谱上的位置。 综上所述，本研究制各抗Cap蛋白的单克隆抗体，利用短肽扫描的方法鉴定出2个Cap蛋白的抗原表位，其中表位138YDPYVNY144为最新发现的表位，通过生物学软件对该表位在蛋白和病毒粒子上定位，从而进行分析，可知抗原表位在病毒粒子上的位置与其反应原性有关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪圆环病毒概述

1．1．1 PCV的基本结构和理化性质

1．1．2 PCV基因分析

1．1．3 PCV2的分离与复制

1．2 PCV2的影响

1．2．1 PMWS的分布及危害

1．2．2 PCV2流行病学特点

1．2．3 PCV2的传染路径

1．3 PCV2的诊断、预防与控制

1．3．1 PCV2的诊断

1．3．2 PCV2的预防与控制

1．4 Cap蛋白免疫原性的研究

1．5 单克隆抗体的研究进展

1．5．1 单克隆抗体的相关研究

1．5．2 抗原表位的鉴定

1．6 PCV2的表位分析

1．7 研究的意义

2 材料与方法

2．1 PCV2 Cap蛋白的原核表达和抗原性比较

2．1．1 病毒、细胞、质粒载体和菌株

2．1．2 主要试剂和仪器

2．1．3 引物设计

2．1．4 PCV2 Cap蛋白基因的扩增与鉴定

2．1．5 PCV2 Cap蛋白原核表达载体的构建

2．1．6 Cap蛋白原核表达及SDS-PAGE分析

2．1．7 原核表达Cap蛋白纯化

2．1．8 原核表达与真核表达Cap蛋白的反应原性比较

2．2 PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

2．2．1 主要细胞、试剂和实验动物

2．2．2 主要试剂的配制

2．2．3 动物免疫

2．2．4 间接ELISA方法的建立

2．2．5 细胞融合

2．2．6 阳性杂交瘤细胞的筛选与培养

2．2．7 单克隆抗体特性鉴定

2．2．8 腹水的制备与纯化

2．2．9 上清与腹水效价的检测

2．3 PCV2 Cap蛋白抗原表位鉴定

2．3．1 主要质粒和菌株

2．3．2 Cap蛋白的截短表达

2．3．3 Cap蛋白抗原表位的鉴定

2．3．4 Cap蛋白抗原表位空间位置分析

3 结果

3．1 PCV2 Cap蛋白原核表达结果鉴定

3．1．1 Cap蛋白基因PCR扩增

3．1．2 重组质粒pET-Cap的酶切鉴定

3．1．3 Cap蛋白的SDS-PAGE分析

3．1．4 Cap蛋白原核表达与真核表达的比较

3．2 PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备

3．2．1 间接ELISA方法的确立

3．2．2 阳性杂交瘤细胞株的筛选

3．2．3 单克隆抗体分泌的稳定性检测

3．2．4 单克隆抗体亚型的鉴定

3．2．5 单克隆抗体的Western blot鉴定

3．2．6 单克隆抗体的IFA鉴定

3．2．7 纯化腹水的SDS-PAGE分析

3．2．8 腹水的效价分析

3．3 Cap蛋白截短表达结果鉴定

3．3．1 重组载体酶切鉴定

3．3．2 重组载体菌液PCR扩增鉴定

3．3．3 截短蛋白SDS-PAGE分析

3．4 Cap蛋白抗原表位鉴定

3．4．1 Cap蛋白抗原表位初步鉴定

3．4．2 Cap蛋白抗原表位精确鉴定

3．5 Cap蛋白抗原表位图谱绘制分析

4 讨论

4．1 Cap蛋白的原核表达与酵母表达的比较

4．2 Cap蛋白的单克隆抗体制备和鉴定

4．3 Cap蛋白的抗原表位鉴定

4．4 Cap蛋白的抗原表位图谱绘制分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文