不同大豆蛋白组分自组装纤维形成能力及相互作用的研究

摘要

大豆蛋白具有很高的营养价值，因而在食品领域得到了广泛的应用。如何提高大豆蛋白的理化特性以及功能特性，从而拓宽大豆蛋白的应用范围成为目前亟待解决的问题。研究发现在非常规条件下，通过控制蛋白质浓度、pH值、加热温度、蛋白质组成等条件，蛋白质之间可以形成不同形态的聚合物。尤其在低pH值、低离子强度、高温长时间加热的条件下可以形成淀粉样纤维聚合物。本试验旨在研究不同加工处理后的大豆蛋白和大豆蛋白的不同成分（7S、11S、酸性亚基、碱性亚基）形成聚合物的形态差异以及不同成分（7S、11S和碱性亚基）对酸性亚基纤维聚合物的影响。同时，本研究还比较了不同聚合物的作用力（二硫键、游离巯基、疏水作用力）、聚合物动力学(ThT)、浊度、DSC、SDS-PAGE、CD)等特性和界面性质（起泡性、乳化性）之间的差异。主要的结论如下: 首先，研究了90℃加热1wt％浓度的4种通过不同加工工艺处理得到的大豆蛋白原料——大豆分离蛋白A(SPIA)、大豆分离蛋白G(APIG)、脱脂豆粉(TZ)和自制原料(ZZ)10h形成聚合物的形态差异。结果显示，4种大豆蛋白原料聚合物的形态存在很大差异。其中SPIA可以形成线状的纤维聚合物。测定ThT荧光强度发现，SPIA的Th T荧光强度值最大，其fmax分别高出SPIG和TZ原料137.07％和49.53％，SPIA的（df/dt）max值也要远远高于其他3种原料。表面疏水性的结果表明，SPIA在加热至2h时增加到最大值，之后变化平缓且保持较大的值，而其他3种原料的表面疏水性在加热至2h时达到最大值后急剧降低。蛋白质的聚合量结果显示在加热2h之后SPIA的聚合物速率比其他3种原料的聚合速率慢，说明SPIA形成聚合物的过程非常缓慢。游离巯基的结果表明，SPIA的游离巯基含量降低幅度为29.73％，比其它3种原料游离巯基的降低幅度低。 基于不同加工工艺处理的4种大豆蛋白原料的前期热处理程度、盐离子强度和蛋白质组分的差异，我们测定灰分、DSC和SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明SPIA的灰分含量较SPIG、TZ和ZZ分别高出35.35％、38.16％和41.03％。从差示扫描量热法(DSC)的结果可以看出，SPIA和SPIG只有一个7S范围内的变性温度，而TZ和ZZ有11S和7S两个范围内的变性温度，其中SPIA的焓变值为34.92±6.01J/g，比其他三种原料的焓变值小。SDS-PAGE的结果表明，SPIA和SPIG的组成成分比TZ和ZZ两种原料的组成成分少了碱性亚基。说明碱性亚基的存在一定程度上抑制纤维聚合物的生成。 基于4种通过不同加工工艺处理得到的大豆蛋白原料(SPIA、SPIG、TZ、ZZ)聚合物形态的差异，主要源自蛋白质组成的不同，我们利用透射电镜研究了pH2.0条件下的7S、11S、酸性亚基和碱性亚基4种组分在95℃加热20h形成聚合物的形态。结果表明，7S和酸性亚基可以形成淀粉样纤维状聚合物，而11S和碱性亚基不能形成淀粉样纤维聚合物。从纤维聚合动力学可以看出，7S和酸性亚基的纤维形成能力（ThT荧光强度值）远高于11S和碱性亚基，7S和酸性亚基的（df/dt）max分别是11S的21和12.7倍，fmax分别是11S的3.5和1.2倍，碱性亚基的ThT荧光强度值很小，不符合ThT荧光动力学线性指标。这种差异在聚合驱动力方面则表现为，7S、11S、酸性亚基、碱性亚基的游离巯基含量下降幅度分别为18.96％、54.19％、27.89％和33.83％，7S和酸性亚基加热过程中二硫键生成量较少。酸性亚基的表面疏水性呈现缓慢下降，而7S呈现缓慢上升至8h达到最大之后趋于平稳，聚合速率慢，11S和碱性亚基呈现急剧下降的趋势，说明可以形成纤维聚合物的7S和酸性亚基加热过程中聚合的过程缓慢，而不能形成纤维聚合结构的11S和碱性亚基聚合的过程非常快速。 与已有的文献报道不同，我们发现11S被解离为酸性亚基和碱性亚基后，酸性亚基可以形成结构良好的纤维聚合物，我们进一步研究了pH值、温度、NaCl、CaCl2和加热时间对酸性亚基形成纤维聚合物的影响。研究的结果表明在pH2.0、95℃加热20h时酸性亚基形成纤维聚合物的形态最佳。NaCl的加入使酸性亚基纤维聚合物的变细。而CaCl2加入使得酸性亚基纤维聚合物枝杈变多。这种聚合条件不同于文献中报道的7S和大豆分离蛋白的聚合条件，酸性亚基形成纤维聚合物的温度更高、加热时间更长。而且酸性亚基形成的纤维聚合物的长度更长更细。 关于蛋白质纤维的报道，文献中主要研究单一蛋白质聚合条件一聚合动力学的变化，缺少其他组分干扰的研究，因此，我们比较了7S、11S和碱性亚基对酸性亚基纤维聚合物的影响。结果表明7S使酸性亚基纤维聚合物的长度变短、枝杈变多。11S和碱性亚基破坏了酸性亚基纤维聚合物，形成了颗粒状团簇聚合物。硫磺素(Th T)的结果表明，7S加入到酸性亚基溶液后，Th T荧光强度值变大，7S和酸性亚基混合物的fmax分别是11S和酸性亚基混合物、碱性亚基和酸性亚基混合物的2.46和3.05倍，是单一酸性亚基的1.53倍;(df/dt)max分别是11S和酸性亚基混合物、碱性亚基和酸性亚基混合物的11.18和36.18倍，是单一酸性亚基的1.18倍。说明7S的加入促进了酸性亚基形成纤维聚合物。同时7S的加入也一定程度上促进了纤维聚合量。7S的这种作用主要源自与酸性亚基的聚合驱动力不同于11S、碱性亚基与酸性亚基聚合的驱动力。游离巯基结果说明，7S加入酸性亚基降低了4.99％二硫键的形成量，而11S和碱性亚基分别增加了39.7％和13.48％的二硫键的形成量;表面疏水性的结果表明，11S和酸性亚基混合物、碱性亚基和酸性亚基混合物加热至2h时，表面疏水性迅速降低，聚合速度快，而7S和酸性亚基的表面疏水性变化平缓，聚合速率慢。因此，平缓的聚合方式以及低二硫键的形成量是多组分杂合蛋白能否形成纤维聚合结构的前提。 蛋白质纤维聚合物在形成过程中，二级结构会发生规律性变化，即α-螺旋结构大幅度降低。我们的研究结果发现，酸性亚基和7S在形成淀粉样纤维聚合物过程中，α-螺旋分别从11.1552±0.23降至4.4841±0.26和从7.2659±0.23降至5.9288±0.16。而碱性亚基不能形成纤维聚合物，α-螺旋从6.3049±0.34降低至6.0428±0.29。7S和碱性亚基分子拥有相近含量的α-螺旋，分别为6.3049±0.34和7.2659±0.23。两者分别加到酸性亚基溶液后，混合共聚后α-螺旋分别降至5.9616％±0.19和9.3636％±0.18，从中可以看出，与碱性亚基不同，7S的加入没有影响α-螺旋的降低。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大豆蛋白的概述

1．1．1 大豆蛋白的主要成分

1．1．2 大豆蛋白氨基酸组成

1．1．3 大豆蛋白7S的简介

1．1．4 大豆蛋白11S的简介

1．2 自组装

1．2．1 自组装的概念

1．2．2 蛋白质自组装

1．2．3 蛋白质自组装的主要作用力

1．3 蛋白质淀粉样纤维聚合物

1．3．1 影响淀粉样纤维聚合物形成的因素

1．3．2 淀粉样纤维聚合物形成的机理

1．4 大豆蛋白纤维聚合物的研究进展

1．5 立题的依据和研究的主要内容

1．5．1 立题依据

1．5．2 研究主要内容

2 材料与方法

2．1 原料与设备

2．1．1 原料

2．1．2 药品

2．1．3 主要试验仪器和设备

2．2 试验方法

2．2．1 7S和11S的分离制备

2．2．2 酸性亚基和碱性亚基的分离

2．2．3 纤维样品的制备

2．2．4 透射电镜(TEM)

2．2．5 Th T荧光分析

2．2．6 浊度

2．2．7 游离巯基

2．2．8 表面疏水性测定

2．2．9 蛋白聚合量

2．2．10 圆二色光谱(CD)

2．2．11 DSC测定

2．2．12 SDS-PAGE凝胶电泳

2．2．13 起泡性

2．2．14 乳化性

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 不同原料形成纤维聚合物能力的比较

3．1．1 聚合物的形态比较

3．1．2 聚合动力学

3．1．3 游离巯基

3．1．4 表面疏水性

3．1．5 灰分含量

3．1．6 热力学差异

3．1．7 蛋白质组分

3．2 大豆蛋白不同组分形成纤维能力的比较

3．2．1 4种组分的分离

3．2．2 聚合形态的比较

3．2．3 Th T变化

3．2．4 浊度

3．2．5 游离巯基

3．2．6 表面疏水性

3．2．7 起泡性

3．2．8 乳化性

3．3 酸性亚基淀粉样纤维聚合物的形成

3．3．1 温度对酸性亚基纤维聚合物的影响

3．3．2 pH对酸性亚基纤维聚合物的影响

3．3．3 离子形式对酸性亚基纤维形成的影响

3．3．4 酸性亚基形成纤维的聚合过程

3．4 不同蛋白混杂共聚对酸性亚基纤维聚合物的影响

3．4．1 聚合物形态的变化

3．4．2 浊度变化

3．4．3 ThT荧光强度

3．4．4 游离巯基

3．4．5 表面疏水性

3．4．6 CD分析

4 讨论

4．1 不同大豆原料形成纤维的比较

4．2 大豆蛋白不同成分的比较

4．3 酸性亚基形成纤维的特征

4．4 大豆蛋白不同成分相互作用的比较

5 结论

5．1 不同大豆蛋白原料纤维形成能力的比较

5．2 酸性亚基纤维聚合物的形成

5．3 不同组分对酸性亚基形成纤维的影响

5．4 纤维聚合物的功能特性

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文