猪PILRs变异剪接体的克隆和功能分析

摘要

疾病是危害畜牧生产的大敌，传统的防疫治病措施不仅成本昂贵，还会引发药物残留等问题，对畜禽产品的食用安全带来巨大威胁。从长远角度来看，用遗传学的方法开展抗病育种，从本质上提高畜禽对病原微生物的抗性，才是解决问题的根本途径。抗病育种的关键是揭示疾病发生的分子机制，确定主效基因和分子标记。本课题组利用Solexa高通量测序技术在猪呼吸道上皮细胞内筛选抗病毒候选基因时，发现有一个tag的表达量受到Poly(I∶C)的显著调控。基因组比对分析表明，这个tag对应于猪Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体(pairedimmunoglobulin-like type2 receptor，PILRs)基因。进一步分析发现，该基因在猪上尚未得到实验克隆。因此，本研究以PILRs为候选基因，利用分子生物学方法对其进行克隆、组织表达和诱导表达研究，并利用双荧光素酶报告系统研究变异剪接对PILRB基因表达的影响，为揭示PILRs在免疫应答过程中的功能和表达调控机制奠定基础。主要研究结果如下: (1)首次克隆了猪PILRA基因的3个变异剪接体(GenBank accession No.KJ143679、KJ143680、KJ143681)，开放阅读框长度依次为816、765和852 bp，分别编码271、254和283个氨基酸残基的多肽链。 (2)RT-qPCR分析表明，PILRA的3个变异剪接体和PILRB的4个变异剪接体在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肌肉、淋巴、大肠、小肠和膀胱等11种组织中均有不同程度的表达，且二者表达规律大致相同:在脾脏中表达量最高，肝脏、肺和淋巴其次，在肌肉中表达量最低。 (3)在Poly(I∶C)处理的PK15细胞内，PILRA基因的表达量降低、PILRB基因表达量增加，并且二者的表达与Poly(I∶C)呈现出时间-剂量依赖效应。 (4)克隆了猪PILRB基因3个变异剪接体的3'UTR，分析了3'UTR区的变异剪接对PILRB转录表达的影响，发现3'UTR区的片段缺失影响着PILRB基因的转录，并且缺失片段越大，转录量越低。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 PILRs家族简介

1．1．1 PILRα

1．1．2 PILRβ

1．2 PILRs家族的研究进展

1．2．1 PILRα的研究进展

1．2．2 PILRβ的研究进展

1．2．3 本实验室的研究进展

1．3 真核生物mRNA的选择性剪接

1．3．1 选择性剪接的形成过程

1．3．2 选择性剪接的模式

1．3．3 选择性剪接的调控

1．4 真核生物的3’非翻译区

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 载体和菌株

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要药品及试剂盒

2．1．5 缓冲液与主要试剂的配制

2．1．6 主要分子生物学软件

2．1．7 相关生物信息学网站

2．2 试验方法

2．2．1 样本采集

2．2．2 总RNA的提取

2．2．3 反转录合成cDNA

2．2．4 引物的设计与合成

2．2．5 PCR扩增

2．2．6 PCR产物的纯化

2．2．7 回收的PCR产物与T载体连接

2．2．8 转化

2．2．9 转化菌落的PCR鉴定

2．2．10 质粒DNA的小规模提取

2．2．11 质粒的酶切鉴定

2．2．12 重组质粒的测序与序列分析

2．2．13 猪PILRB 3’UTR区双荧光素酶报告基因载体构建

2．2．14 细胞的培养、诱导、转染和检测

2．2．15 实时荧光定量PCR

2．3 统计分析

3 结果与分析

3．1 猪PILRA基因的克隆与序列分析

3．1．1 克隆

3．1．2 猪PILRA基因核苷酸序列的分析

3．1．3 猪PILRA基因蛋白一级结构分析

3．1．4 猪PILRA基因蛋白三级结构分析

3．1．5 猪PILRA同源性分析

3．2 PILRs的表达

3．2．1 组织表达谱的构建

3．2．2 诱导表达

3．3 猪PILRB基因3’UTR区缺失的功能研究

3．3．1 猪PILRB基因3’UTR区序列分析

3．3．2 猪PILRB基因3’UTR区的克隆

3．3．3 猪PILRB基因3’UTR区报告基因载体构建

3．3．4 3’UTR区变异剪接对PILRB基因表达的影响

4 讨论

4．1 猪PILRA基因的克隆、同源性和蛋白结构分析

4．2 猪PILRs基因的表达与分析

4．2．1 组织表达

4．2．2 诱导表达

4．3 猪PILRB基因3’UTR区双荧光素酶活性分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文