Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的调节功能

摘要

Pten基因作为一个肿瘤抑制基因，在多种细胞活动中发挥调节作用，包括细胞的增殖、粘附、凋亡等。目前国内外关于Pten基因在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。本研究以泌乳中期的奶牛乳腺上皮细胞为模型，探索Pten基因的表达与奶牛乳腺发育和泌乳之间的关系，目的在于揭示Pten基因在奶牛乳腺中的调节作用，为动物乳腺发育和泌乳调节机制的研究提供基础资料，为人工调控乳品质和乳产量提供理论依据。 本研究以中国荷斯坦奶牛作为实验动物，应用荧光定量qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学技术，对奶牛不同发育阶段及不同乳品质的乳腺组织中Pten mRNA和蛋白质的相对表达量进行检测;以体外培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，构建重组质粒pGCMV-Pten-IRES-EGFP，对细胞进行瞬时转染，进行Pten基因过表达实验;应用RNA干扰的方法用Pten siRNA瞬时转染细胞，进行Pten基因抑制实验。分别用相关试剂盒检测Pten基因过表达和抑制之后细胞β-酪蛋白、甘油三酯以及乳糖分泌的情况，为了检测Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响，分别应用CASY-TT细胞分析仪和流式细胞仪检测细胞活性和细胞周期，采用荧光定量qRT-PCR和Western blotting技术，在mRNA和蛋白水平检测与泌乳相关的信号通路基因的表达变化;同时，添加外源性催乳素和葡萄糖培养细胞，检测培养液上清中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的浓度，以及Pten基因的表达量变化，从而探索Pten基因在催乳素诱导的葡萄糖转化生成乳糖过程中的作用。 研究结果表明，泌乳期Pten基因表达量显著低于干乳期。与泌乳期低乳品质（乳蛋白含量＜3.0％，乳脂含量＜3.5％）奶牛乳腺相比，泌乳期高乳品质（乳蛋白含量＞3.0％，乳脂含量＞3.5％）的奶牛乳腺组织中Pten mRNA和蛋白表达水平分别降低了30％和40％; Pten基因过表达可抑制奶牛乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的分泌量(P＜0.05)，使奶牛乳腺上皮细胞中MAPK、Cyclin D1、AKT、mTOR、S6K1、STAT5、SREBP1、PPARγ、PRLR、GLUT1的表达下调(P＜0.05)，并上调4EBP1的表达水平(P＜0.05); Pten基因抑制实验表现出相反的结果;而Pten基因的过表达和抑制对ELF5的表达均无显著影响（P＞0.05）。催乳素的添加能促进细胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖（P＜0.05），并下调Pten基因表达量（P＜0.05）;葡萄糖的添加显著增加了β-酪蛋白和乳糖分泌量（P＜0.05），但甘油三酯含量无显著变化（P＞0.05），同时Pten基因的表达量无明显改变（P＞0.05）。 综上所述，Pten基因参与调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳的过程，负向调节细胞的活力、增殖能力和细胞周期，并能抑制奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖;这种调节作用是通过Pten基因靶向调节PI3K-AKT信号通路，进而调节其他泌乳相关信号通路基因的表达而实现的;同时发现Pten基因的表达受催乳素的负调节，但葡萄糖对Pten基因的表达水平无显著影响。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育的研究进展

1．1．1 奶牛乳房和乳腺的解剖结构

1．1．2 奶牛乳腺发育的形态学和功能学变化

1．2 奶牛乳腺泌乳机理及营养调节机制

1．2．1 乳汁的合成与分泌机制

1．2．2 催乳素对泌乳的调节作用

1．2．3 葡萄糖对泌乳的调节作用

1．3 奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究进展

1．3．1 乳腺细胞的原代培养

1．3．2 奶牛乳腺上皮细胞系的建立

1．4 泌乳相关信号转导途径及泌乳功能基因的筛选

1．4．1 泌乳相关信号通路

1．4．2 乳腺泌乳功能基因组学的研究进展

1．5 Pten基因功能的研究进展

1．5．1 Pten基因的发现

1．5．2 Pten基因及其编码蛋白的结构

1．5．3 Pten基因的作用机制和功能

1．5．4 Pten基因在乳腺中的相关功能研究

1．6 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料、试剂和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 qRT-PCR检测奶牛乳腺组织Pten mRNA的表达

2．2．2 Western blotting检测奶牛乳腺组织PTEN蛋白的表达

2．2．3 PTEN蛋白在奶牛乳腺组织中的免疫荧光定位与半定量分析

2．2．4 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

2．2．5 PTEN蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的定位分析

2．2．6 Pten基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

2．2．7 Pten基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

2．2．8 催乳素和葡萄糖对奶牛乳腺上皮细胞中Pten基因表达的影响

2．2．9 数据的处理和统计分析

3 结果

3．1 奶牛乳腺组织中Pten基因的mRNA表达水平

3．1．1 奶牛乳腺组织RNA提取的电泳结果

3．1．2 荧光定量qRT-PCR检测目的基因的mRNA表达

3．2 奶牛乳腺组织中PTEN蛋白的表达水平

3．3 PTEN蛋白的乳腺组织免疫荧光定位与半定量分析

3．4 泌乳期奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及鉴定

3．4．1 奶牛乳腺上皮细胞的纯化和鉴定

3．4．2 奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18鉴定结果

3．5 目的蛋白PTEN激光共聚焦细胞内定位的观察

3．6 Pten基因过表达的实验结果

3．6．1 Pten基因PCR扩增产物

3．6．2 测序结果

3．6．3 pGCMV-Pten-IRES-EGFP真核表达载体的构建和重组质粒的酶切验证

3．6．4 去内毒素质粒的双酶切法验证

3．6．5 最佳转染时间的筛选

3．6．6 细胞转染试剂的最佳浓度和基因过表达效率检测

3．6．7 Pten基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞功能的影响

3．7 Pten基因抑制的实验结果

3．7．1 Pten siRNA最佳干扰片段和最佳干扰时间

3．7．2 Pten siRNA的最佳转染浓度和干扰效率

3．7．3 Pten基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞功能的影响

3．8 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能和Pten基因表达水平的影响

3．8．1 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

3．8．2 催乳素和葡萄糖处理对奶牛乳腺上皮细胞Pten基因表达水平的影响

3．9 Pten基因调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳图解

4 讨论

4．1 Pten基因在不同泌乳时期奶牛乳腺组织中的表达差异分析

4．2 Pten基因过表达和抑制对奶牛乳腺上皮细胞活力和细胞周期的影响

4．3 Pten基因过表达和抑制对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

4．4 Pten基因过表达和抑制对泌乳相关通路基因表达的影响

4．4．1 细胞增殖与周期相关通路基因

4．4．2 乳蛋白合成相关通路基因

4．4．3 乳脂肪合成相关通路基因

4．4．4 乳糖合成相关通路基因

4．5 Pten基因参与催乳素诱导的葡萄糖转化为乳糖的调节作用

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文