阿魏酸酯酶基因在黑曲霉中的同源表达

摘要

阿魏酸酯酶能够切断植物纤维材料中半纤维素与纤维素之间相交连的酯键，将阿魏酸释放出来，是一种参与植物细胞壁降解的重要酶类。阿魏酸酯酶主要来源于微生物，但其产量低，表达水平不高远远不能满足工业化生产要求。之前已有阿魏酸酯酶在毕赤酵母表达系统中分泌表达的研究报道，表达量仅为0.0679 U/g，其生产水平距离大规模工业化生产仍存在差距。黑曲霉是世界公认的一种安全生产菌种，其具有优良的蛋白质分泌能力、高效准确的翻译后加工、与高等真核生物相类似的糖基化修饰系统等特点越来越受到人们的关注，同时黑曲霉是一种工业化生产阿魏酸酯酶的主要菌种，利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。 本研究利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因（faeA）的编码区，构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA，并通过农杆菌介导法转化黑曲霉，筛选同源重组转化子。进而对同源重组转化子的发酵液上清进行酶活检测和SDS-PAGE分析，结果表明实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达，从而为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。 本实验主要研究结果如下: 1.黑曲霉表达载体卡盒pSZHG的构建 利用CTAB法提取的黑曲霉基因组DNA为模板，采用PCR技术分别克隆5'GLA同源臂和3，GLA同源臂，将两个片段连接起来之后，与实验室之前构建好的载体pSZH连接，构建成黑曲霉表达载体卡盒pSZHG。 2.阿魏酸酯酶faeA基因黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的构建 以黑曲霉糖化酶生产菌种CICC2462基因组DNA为模板，利用基因特异性引物，PCR扩增黑曲霉内源基因faeA，基因与登录号AF361950.1基因序列相似性为100％。将连接T载体的faeA基因质粒与表达载体卡盒pSZHG分别用ApaⅠ、ClaⅠ双酶切并连接，构建阿魏酸酯酶重组表达载体pSZHG-faeA。 3.农杆菌介导法转化黑曲霉及同源重组转化子的筛选鉴定 利用农杆菌冻融法将重组黑曲霉表达载体pSZHG-faeA转入农杆菌AGL1中，农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化，采用PCR技术鉴定出4株阳性转化子。利用同源重组引物对鉴定出的4株阳性转化子进行PCR鉴定，结果4株阳性转化子均扩增出1701bp的目的条带，证明是同源重组转化子，pSZHG-faeA载体转化的同源重组率为100％。 4.阿魏酸酯酶在黑曲霉中的表达 分别用去淀粉麦麸法和阿魏酸甲酯法两种方法测定重组阿魏酸酯酶的酶活性，结果表明利用去淀粉麦麸法测得重组阿魏酸酯酶酶活最高达18.6mU/mL，而利用阿魏酸甲酯法测得的重组阿魏酸酯酶最高酶活达22.12 mU/mL。 将酶活达到最高值的重组阿魏酸酯酶发酵液上清进行SDS-PAGE检测，结果显示4株重组菌株均在36KDa处有明显目的条带，明显高于出发菌株。将SDS-PAGE分析结果中4株重组菌株蛋白条带送交公司进行蛋白质谱分析，结果表明4株重组菌株分泌的蛋白确实为黑曲霉中阿魏酸酯酶蛋白。经ALPHAIMAGER SYSTEMS软件分析，4株重组菌株蛋白表达量为188μg/mL～262μg/mL。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 阿魏酸酯酶的来源

1．2．2 阿魏酸酯酶的制备

1．2．3 阿魏酸酯酶的分类

1．2．4 阿魏酸酯酶的催化机理及蛋白结构

1．2．5 阿魏酸酯酶与多糖降解酶的协同作用

1．2．6 阿魏酸酯酶的应用

1．3 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与载体

2．1．2 酶和主要试剂

2．1．3 常用试剂的配制

2．1．4 培养基

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 黑曲霉基因组DNA的提取

2．2．2 基因克隆

2．2．3 根癌农杆菌介导的黑曲霉的遗传转化

2．2．4 同源重组菌株中潮霉素抗性基因的消除

2．2．5 采用两种方法测定重组菌株酶活

2．2．6 重组菌株分泌蛋白检测

3 结果与分析

3．1 黑曲霉pSZHG表达载体卡盒的构建

3．1．1 黑曲霉基因组的提取

3．1．2 黑曲霉糖化酶片段的构建

3．1．3 阿魏酸酯酶黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的构建

3．2 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

3．2．1 冻融法转化农杆菌

3．2．2 农杆菌与黑曲霉的共培养

3．2．3 黑曲霉转化子的筛选和鉴定

3．3 黑曲霉同源重组转化子的筛选与鉴定

3．4 阿魏酸酯酶在重组菌株的表达

3．4．1 利用去淀粉麦麸法测定阿魏酸酯酶活性

3．4．2 利用阿魏酸甲酯法测定阿魏酸酯酶活性

3．5 阿魏酸酯酶在重组菌株的蛋白表达

3．6 阿魏酸酯酶重组菌株蛋白质谱分析

4 讨论

4．1 阿魏酸酯酶在黑曲霉中的表达

4．2 黑曲霉表达系统的安全性

5 结论

5．1 黑曲霉表达载体卡盒pSZHG的构建

5．2 阿魏酸酯酶faeA基因黑曲霉表达载体pSZHG-faeA的构建

5．3 黑曲霉重组转化子的筛选及同源重组转化子的鉴定

5．4 阿魏酸酯酶在黑曲霉中的表达

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文