连续小株繁殖大白菜MSAP分析及相关基因表达分析

摘要

春化是大白菜[Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson]抽薹开花过程的一个必须环节，植株必须经过一定的低温诱导，才能由营养生长转变为生殖生长，近而抽薹开花;大白菜有先期抽薹现象，即抽薹时间发生在其营养体还未充分长成之前，抽薹后因其失去了食用价值而导致经济效益大幅度降低。我们在生产实践中发现连续小株繁殖后会导致大白菜结球性降低，植株更易抽薹开花。试验以A161、A105自交系为试验材料，通过春化处理得到小株繁殖一次、连续小株繁殖二次、连续小株繁殖三次和大母根采种种子，比较种植后植株表型的特征差异;同时采用MSAP技术进行基因组甲基化分析，对差异性片段进行克隆和荧光定量qPCR分析。本试验初步分析了连续小株繁殖导致大白菜冬性减弱的分子机制，对大白菜良种繁育具有重要的指导意义。 本试验取得如下结论: 1通过对大白菜A161和A105的大母株采种、小株繁殖一次、连续小株繁殖二次、连续小株繁殖三次的植株进行冬性调查，发现大白菜连续春化次数越多，结球性越差，植株中心柱长度也随之增加，更易抽薹开花，植株冬性也随之减弱。 2通过对大白菜A161和A105的大母株采种、小株繁殖一次、连续小株繁殖二次、连续小株繁殖三次的基因组DNA进行MSAP甲基化分析，发现大白菜自交系基因组甲基化水平、全甲基化水平与半甲基化水平变化趋势一致，都是随着连续春化次数的增加而逐渐降低。 3利用32对引物对不同处理的A161和A105两个大白菜自交系基因组DNA进行甲基化多态性统计分析;甲基化多态性比率在1.8％～15.6％之间，平均甲基化多态性比率为6.4％;发现全甲基化条带多于半甲基化条带，同时32对引物之间甲基化多态性存在较大的差异。 4根据基因组DNA甲基化变化模式，对不同处理的A161和A105两个大白菜自交系基因组DNA进行MSAP统计分析，共找到17条甲基化发生变化的差异条带，其中12条为去甲基化条带，5条为发生甲基化条带。 5本试验通过对大白菜基因组DNA甲基化特异性条带的回收、克隆和测序分析，共确定4个甲基化发生变化的基因，分别为BraAL5、BraAPC1、BraEMP3和BraUBC26。 6通过甲基化差异基因在不同处理中的表达分析，发现:BraAPC1、BraEMP3和BraUBC26三个基因，在小株繁殖一次中的表达量高于大母根采种的表达量，之后随着小株繁殖代数的增高表达量逐渐降低;BraAL5春化采种的表达量低于大母根采种，并且表达量随着连续小株繁殖代数的增加而逐渐降低。 7通过甲基化差异基因在春化不同时间后的表达分析，发现:BraAPC1、BraEMP3和Bra UBC26在春化一周后表达量升高。之后随着春化时间延长表达量降低;BraAL5春化后表达量降低，并且随着春化时间延长表达量降低，春化三周后表达量显著低于未春化处理。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 春化作用研究现状

1．2．2 DNA甲基化

1．2．3 春化作用与甲基化的关系

1．2．4 MSAP技术

1．2．5 Real-Time qPCR

1．3 主要研究内容

1．4 本试验技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 分子生物学及生化试剂

2．1．3 主要试验仪器

2．1．4 试验软件

2．2 植物材料的处理和取样

2．3 试验方法

2．3．1 大白菜的冬性调查

2．3．2 MSAP法检测大白菜基因组DNA甲基化

2．3．3 甲基化差异片段的克隆测序与序列分析

2．3．4 大白菜甲基化差异基因的Real-time RT-qPCR分析

3 结果与分析

3．1 不同处理大白菜冬性差异分析

3．2 MSAP检测大白菜全基因组DNA甲基化

3．2．1 大白菜全基因组DNA的提取

3．2．2 大白菜全基因组甲基化类型

3．2．3 大白菜全基因组DNA甲基化多态性分析

3．2．4 不同处理的大白菜基因组DNA甲基化比率分析

3．2．5 大白菜全基因组甲基化变化模式

3．3 甲基化差异片段的克隆测序与序列分析

3．3．1 甲基化差异条带的回收

3．3．2 阳性克隆的鉴定

3．3．3 测序及序列分析

3．4 大白菜甲基化差异基因的Real-time RT-qPCR表达分析

3．4．1 大白菜总RNA的提取

3．4．2 溶解曲线分析

3．4．3 甲基化差异基因在不同春化代数中的表达分析

3．4．3 甲基化差异基因在不同春化时间中的表达分析

4 讨论

4．1 不同处理大白菜冬性差异分析

4．2 MSAP检测基因组DNA甲基化

4．3 大白菜甲基化差异基因的克隆分析

4．4 甲基化差异基因的RT-qPCR表达分析

4．5 本试验的创新点

5 结论

致谢

参考文献

附录

附录A 英文缩略语表

附录B 试验中药品的配制

攻读硕士学位期间发表的学术论文