Sip蛋白高亲和性噬菌体介导的牛源无乳链球菌间接ELISA方法的建立

摘要

奶牛乳腺炎是奶牛最常见的疾病之一，影响奶牛的产奶量和牛奶品质，严重的可导致奶牛泌乳功能丧失甚至被迫淘汰，大大降低奶牛养殖的经济效益，给养牛业造成巨大的经济损失。同时病原微生物可通过污染的奶制品而感染人，对人类健康造成危害。无乳链球菌是奶牛乳腺炎的主要病原之一，无乳链球菌感染虽不引起乳房明显的脓肿或纤维化，但是可以导致腺体感染，造成产奶量持续减少。其表面免疫相关蛋白(Sip)暴露在细菌的表面，在多种血清型的无乳链球菌菌株中均有表达，是细菌重要的黏附和定植因子之一，具有较好的免疫保护作用和良好的抗原性，是无乳链球菌重要的候选疫苗抗原之一。九种不同血清型菌株Sip蛋白氨基酸序列比较结果显示此蛋白质高度保守。因此，利用此蛋白开发一个迅速有效的检测方法监控无乳链球菌感染，提高乳制品的质量和安全，具有重要的应用价值。
　　本研究参照GenBank公布的牛源无乳链球菌Sip基因序列(AF151361)设计一对特异性引物，成功构建pGEX-6p-1-Sip原核表达质粒。经IPTG诱导表达及条件优化，成功在大肠杆菌感受态Rosetta(DE)中表达了分子量为59.8 Ku的无乳链球菌Sip重组蛋白，其优化条件为终浓度1.0 mmol/L IPTG37℃恒温诱导5h。纯化的重组蛋白为其后噬菌体的筛选提供了材料。
　　随后，以纯化的无乳链球菌Sip重组蛋白为靶分子，用M13噬菌体cDNA文库，进行4轮噬菌体生物淘选。无乳链球菌Sip蛋白的首轮包被量为10μg/孔，此后每轮依次减半，噬菌体每轮投入量均为1.5×1011 CFU/μL。经过噬菌体淘洗、扩增和滴度测定，最终在总数少于100的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取10个噬菌体蓝斑于摇菌管中进行4.5 h扩增后测定其滴度。扩增后的10个噬菌体分别进行噬菌体与靶分子的噬菌体ELISA亲和能力的测试，检测结果显示，所获取的10个随机噬菌体均与靶分子具有高度的亲和能力，为ELISA方法检测无乳链球菌的建立奠定了基础。
　　利用能与无乳链球菌Sip蛋白结合的噬菌体作为第一抗体，M13多抗作为第二抗体，建立了可快速检测含无乳链球菌奶样的间接ELISA检测方法并进行了条件优化。优化结果为:抗原包被浓度（即敏感度）为10 CFU/mL/孔，噬菌体最佳作用浓度为108 PFU/mL;抗原最佳包被方式确定为37℃包被2h时后4℃过夜的方式;最佳封闭剂的选择为1.0％BSA磷酸盐缓冲液置37℃封闭3 h;噬菌体最佳孵育时间为60 min; M13多抗1∶1000倍稀释孵育45 min;酶标抗体最佳稀释度为1∶4000，最佳孵育时间为45 min。并用所建立的间接ELISA检测方法进行了无乳链球菌敏感性、特异性和临床样本的检测，敏感性可检测到10 CFU/mL。临床样本检测了某牧场54份患奶牛乳腺炎的奶样，检测阳性率达14.286％。本实验将噬菌体表面展示技术与ELISA检测方法相结合，为奶牛乳腺炎无乳链球菌提供了简便高效的新型检测方法。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺炎概述

1．2 无乳链球菌研究进展

1．2．1 无乳链球菌简介

1．2．2 无乳链球菌表面蛋白研究进展

1．2．3 无乳链球菌主要毒力因子研究进展

1．2．4 无乳链球菌的检测方法

1．3 噬菌体展示技术的概述

1．3．1 噬菌体展示技术的基本原理及类型

1．3．2 噬菌体展示技术的应用

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种载体及质粒

2．1．2 工具酶、试剂盒和抗体试剂

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 质粒提取

2．2．3 目的基因的扩增

2．2．4 目的序列与载体的连接与鉴定

2．2．5 无乳链球菌Sip重组蛋白的诱导表达

2．2．6 蛋白的纯化

2．2．7 蛋白的复性

2．2．8 噬菌体的筛选

2．2．9 噬菌体蓝斑的扩增及滴度测定

2．2．10 噬菌体DNA的快速纯化、PCR检测及ELISA结合实验

2．2．11 间接ELIAS检测方法的建立

3 结果与分析

3．1 原核表达

3．1．1 无乳链球菌Sip基因的亚克隆

3．1．2 重组克隆载体的鉴定

3．1．3 目的蛋白的诱导表达

3．1．4 重组蛋白的纯化

3．2 噬菌体十二肽库的生物淘选噬菌体

3．2．1 噬菌体十二肽库对靶分子的淘洗结果

3．2．2 噬菌体单克隆的核甘酸PCR测定结果

3．2．3 噬菌体ELISA结合鉴定结果

3．3 间接ELISA检测方法的建立及条件优化

3．3．1 抗原最佳包被浓度和噬菌体最佳稀释度

3．3．2 抗原最佳包被方式

3．3．3 最佳封闭剂和最佳封闭时间

3．3．4 噬菌体最佳孵育时间

3．3．5 M13多抗最佳稀释度和最佳孵育时间

3．3．6 酶标抗体最佳稀释度和最佳孵育时间

3．3．7 间接ELISA阴阳性判定标准的建立

3．3．8 特异性试验

3．4 临床样品的检测

4 讨论

4．1 无乳链球菌Sip蛋白的选择

4．2 无乳链球菌Sip蛋白的表达

4．3 与无乳链球菌Sip蛋白亲和的噬菌体的筛选

4．4 噬菌体介导的间接ELISA检测方法的建立

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文