低温启动堆肥菌剂的筛选优化及相关应用研究

摘要

2011年全国畜禽粪便产生量达到25.45亿吨，由于我国目前缺少有效的管理及治理措施，已造成严重的环境污染。另一方面，根据相关资料，每年全球生物质能产生量是人类能源消耗总量的5-10倍，而其中较大部分是纤维素。作为农业大国，我国的秸秆产量非常大，其中所富含的纤维素物质不容易发生降解，如果能将二者相互结合利用，将对于土壤肥力的增加，环境污染的减少及帮助农作物增产产生较大的意义。
　　但是东北地区尤其是哈尔滨地区属于高寒地区，秋冬季节的低温会大大降低微生物的活性，从而造成堆肥的启动困难、秸秆降解效率低等问题，因此，我们需要利用相关技术来提高低温情况（10℃以下）下堆肥启动的快速性，进而提高生产效率及质量。
　　本研究主要以农村自然堆肥及稻田土等作为菌种来源，利用传统的平板分离技术，通过初筛及进一步的基于两因素的复筛，得到了低温纤维素降解菌DF3、DF8、DF25三株，它们分别属于Alcaligenes sp.，Alcaligenes sp.和Brevundimonas terrae(T)。低温淀粉降解菌T4、T10及DF27三株，其中T4属于Brucellaceae bacterium KAV，低温糖降解菌DF26，属于Pusillimonas sp，。然后采用添加多功能复合菌的方式进行纤维素降解，继而研究了两株纤维素降解菌DF3、DF8的摇瓶发酵产酶的培养条件响应面优化，从碳源、氮源、接种量、pH值、表面活性剂的含量、发酵时间、摇速、温度等八个因素进行单因素试验，然后进行P-B设计试验，最陡爬坡试验及BBD试验和验证试验，最后求解得出DF3的最佳产酶条件为接种量8.9ml，pH值为7.5，温度为40℃，氮源为9.5g/L时酶活力为1848IU，求解得出DF8的最佳产酶条件为接种量5.7ml，转速为105rpm，碳源为11.5g/L时酶活力为572IU。最后将菌剂固态发酵后应用于接种堆肥及施肥等相关应用，将菌剂固态发酵后接种堆肥，发现接种多功能菌剂的处理升温迅速，比对照提前四天到达高温期，起温快，温度达到60℃后至少7d，说明本菌剂的低温启动效果较好。随后研究了施化肥及有机肥对白菜地所产生的不同影响，结果发现施用有机肥以后能有效提高土壤中腐殖酸的含量，测产得到堆肥产品组亩产约为9990kg，化肥组约为8702kg，空白组约为7361kg，效果良好。通过本研究，以期实现稻秆等纤维素类废弃物与畜禽粪便的结合及有效利用，以缓解畜禽粪便带来的环境污染，并提高稻杆等纤维素的利用率。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 能源及环境问题

1．2 纤维素概述

1．3 本研究的选题背景

1．4 纤维素酶系统

1．4．1 纤维素酶简述

1．4．2 产纤维素酶的主要微生物

1．4．3 纤维素酶的诱导物

1．5 纤维素酶的应用及生产

1．5．1 纤维素酶在饲料中的应用

1．5．2 纤维素酶在食品工业中的应用

1．5．3 纤维素酶在其他行业中的应用

1．5．4 纤维素酶在工农业废弃物处理中的应用

1．5．5 固态发酵制备纤维素酶

1．5．6 液体发酵制备纤维素酶

1．6 好氧堆肥

1．7 本课题研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂及仪器

2．1．2 培养基及相关溶液的配制

2．1．3 采样来源

2．2 试验方法

2．2．1 样品的采集、处理和保存

2．2．2 菌株的分离纯化

2．2．3 不同作用菌株的筛选

2．2．4 菌种的保存

2．2．5 低温降解菌株的性状研究

2．2．6 生理生化试验

2．2．7 16S rDNA鉴定

2．2．8 低温降解菌株的拮抗协同作用观察

2．2．9 低温降解纤维素菌株的产酶条件的响应面优化

2．2．10 菌株的发酵

2．2．11 发酵菌剂的堆肥应用

2．2．12 堆肥产品施肥应用

3 结果与分析

3．1 菌株的筛选

3．1．1 菌株的初筛

3．1．2 低温降解菌株的复筛

3．2 低温降解菌株的拮抗协同作用观察

3．3 葡萄糖标准曲线

3．4 生理生化试验

3．5 16S rDNA鉴定

3．5．1 16S rDNA序列测定

3．5．2 16SrDNA同源性比较分析

3．5．3 系统发育树

3．6 DF3单因素试验

3．6．1 碳源种类的单因素试验结果

3．6．2 碳源数量的单因素试验结果

3．6．3 氮源种类的单因素试验结果

3．6．4 氮源数量的单因素试验结果

3．6．5 吐温-80添加量的单因素试验

3．6．6 培养温度的单因素试验

3．6．7 摇床转速的单因素试验

3．6．8 接种量的单因素试验

3．6．9 初始pH值的单因素试验

3．6．10 培养时间的单因素试验

3．7 DF8的单因素实验结果

3．7．1 碳源种类的单因素试验结果

3．7．2 碳源数量的单因素试验结果

3．7．3 氮源种类的单因素试验结果

3．7．4 氮源数量的单因素试验结果

3．7．5 吐温-80添加量的单因素试验

3．7．6 培养温度的单因素试验

3．7．7 摇床转速的单因素试验

3．7．8 接种量的单因素试验

3．7．9 初始pH值的单因素试验

3．7．10 培养时间的单因素试验

3．8 DF3 Plackett-Burman试验设计及结果

3．9 DF8 Plackett-Burman试验设计及结果

3．10 最陡爬坡试验

3．10．1 DF3最陡爬坡试验

3．10．2 DF8最陡爬坡试验

3．11 DF3 BBD试验设计及结果验证

3．12 DF8 BBD试验设计及结果验证

3．13 堆肥温度

3．14 两种不同施肥处理对土壤肥力指标的影响

3．14．1 两种不同施肥处理对土壤腐殖酸成分的影响

3．14．2 两种不同施肥处理对土壤肥力指标的影响

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文