香鳞毛蕨中黄酮代谢途径关键酶基因的克隆与功能验证

摘要

香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L)Schott]是一种多年生的天然药用植物。在我国黑龙江省五大连池地区分布最为广泛。香鳞毛蕨的生境具有特殊性，比较倾向于生长在火山喷发后的熔岩地区，对一些特殊环境都有一定的适应性，但是香鳞毛蕨自然生长的种群一旦遭到破坏，恢复起来非常缓慢。迄今为止，一些研究人员主要在形态解剖学观察、化学成分的提取分离及药理活性等方面对香鳞毛蕨进行研究，关于香鳞毛蕨中次生代谢途径相关酶基因的研究进行的较少。随着对香鳞毛蕨的不断开发利用，野生香鳞毛蕨面临着濒危的现状，因此对人工种植高含量有效物质香鳞毛蕨植株的研究迫在眉睫。
　　本论文主要是以香鳞毛蕨组织培养植株为材料，根据电子克隆获得的序列及其他已知序列的保守区设计特异引物，分别克隆了香鳞毛蕨中的CHI、F3H、PAL及C4H基因的保守片段，同时初步筛选出了香鳞毛蕨中PAL基因家族的三个成员。利用Real-Time PCR方法对DfPAL基因家族DfPAL1、DfPAL2、DfP-AL3及DfC4H四个基因在香鳞毛蕨中的不同组织及不同处理条件下的基因表达情况进行检测，初步确定对DfPAL3和DfC4H进行深入地研究。本文采用RACE技术克隆了DfPAL3和DfC4H的cDNA全长，利用生物信息学分析，对两个序列的结构、蛋白质结构和理化性质进行了研究，通过构建系统发育树确定香鳞毛蕨的分类系统位置。同时成功构建了植物表达载体pBI121-DfC4H和pBI121-DfCHS，通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化，通过PCR方法检测了转基因植株，收取T1代种子。同时对转基因植株的第一代谢产物和终产物进行测定，来初步验证DfC4H和DfCHS基因在黄酮类化合物生物合成途径中的功能，从而为提高代谢产物进行基因调控提供了理论依据，为进一步研究DfC4H和DfCHS基因在香鳞毛蕨中的功能奠定了基础。
　　本研究中得到的主要实验结果如下:
　　1.本论文通过对香鳞毛蕨转录组数据进行分析，筛选出黄酮代谢途径关键酶基因四个，分别为DfCH-I、DfF3H、DfPAL及DfC4H,同时又对这四个基因进行了电子克隆。
　　2.从香鳞毛蕨中克隆了DfCHI基因保守序列，大小为452bp，与其他已知序列的一致性为55％-57％，GenBank序列号为KP658975。
　　3.从香鳞毛蕨中克隆了DfF3H基因保守序列，大小为693bp，与其他已知序列的一致性为63％-62％，GenBank序列号为KP658976。
　　4.从香鳞毛蕨中分离得到苯丙氨酸解氨酶基因家族的三个成员，分别命名为DfPAL1、DfPAL2、Df-PAL3。保守片段长度均为880 bp，三者之间的序列一致性为84.30％，GenBank序列号分别为:KF830704，KJ634145，KJ634146。通过Blastx分析得知，DfPAL1、DfPAL2和DfPAL3与已知序列的一致性分别为97％、96％及97％。
　　5.通过Real-Time PCR方法对DfPAL基因家族及DfC4H基因在不同组织部位及不同处理条件下进行表达量的检测。结果分析可知，DfPAL3在配子体中的表达量最高，叶柄中次之，在孢子中的表达量最低，而DfPAL1和DfPAL2在这些部位的表达量很低，而且没有什么明显差异。DfC4H的变化趋势与DfP-AL3大致相同。低温、高温以及紫外处理后发现，DfPAL2及DfC4H的表达量均变化较大，而DfPAL1和DfPAL3则表达量比较稳定，且没有明显的差异。
　　6.通过RT-PCR和RACE技术，首次从香鳞毛蕨中克隆出DfPAL3的cDNA全长，大小为2370bp，ORF长度为1608bp，编码535个氨基酸，GenBank序列号为KJ634146.2，DfPAL3蛋白ID为AID16057.2。生物信息学分析表明，DfPAL3蛋白的分子量、等电点、分子式分别为57.1966 kDa、5.88及C2537H4081N697O767S18，属于稳定的疏水性蛋白;二级结构预测为α型蛋白;蛋白功能区分析显示，DfPAL3蛋白含有PAL的功能区域，是PAL的家族成员之一;亚细胞定位分析表明，DfPAL3蛋白定位于内质网膜的可能性最大;没有发现信号肽，属于非分泌性蛋白;也没有跨膜蛋白的存在;在DfPAL3蛋白的515-528氨基酸之间存在卷曲螺旋结构;对其进行糖基化和磷酸化位点分析显示，包含N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位点个数分别为1、62和25;多重序列比对分析发现，与松叶蕨、水韭、阴地蕨、蕨的相似性分别为73％、74％、77％及93％。系统进化树结果显示，与蕨类植物阴地蕨和松叶蕨的亲缘关系最近，与裸子植物的亲缘关系次之，与被子植物的亲缘关系略远。
　　7.通过RT-PCR和RACE技术，首次从香鳞毛蕨中克隆出DfC4H的cDNA全长为2063bp，ORF长度为1527bp，编码508个氨基酸，GenBank序列号为KF830705.2。DfC4H蛋白ID为AHI17493.2。生物信息学分析预测其分子量、等电点、分子式分别为58.1908kDa、8.92、C2649H4189N719O719S18;为不稳定的亲水性蛋白;二级结构预测为混合型蛋白;蛋白功能区预测表明，DfC4H蛋白含有细胞色素P450功能区域，是细胞色素P450的家族成员之一;定位分析显示，DfC4H蛋白定位在细胞膜的可能性最大;DfC4H蛋白可能含有信号肽，在N端有膜蛋白的存在;也可能存在卷曲螺旋结构;对其进行糖基化和磷酸化位点分析显示，含有N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位点个数分别为1、36和19;进化分析表明，与藓类植物小立碗藓的亲缘关系最近，与裸子植物次之，与被子植物的亲缘关系略远。
　　8.本文成功构建了植物表达载体pBI121-DfC4H,通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化，利用PCR方法对转基因DfC4H植株进行检测，获得T1代种子。对T1代植株第一代谢产物对香豆酸含量的HPLC检测结果显示，转基因植株中的含量明显高于野生型。通过对黄酮类化合物合成途径的终产物花色素苷含量进行测定，转基因DfC4H植株中花色素苷的含量明显高于野生型中的含量。
　　9.本文成功构建了植物表达载体pBI121-DfCHS，通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化，利用PCR方法对转基因DfCHS植株进行检测，获得T1代种子。通过HPLC方法对T1代植株的第一代谢产物查尔酮含量进行测定，结果显示，转基因DfCHS植株中的含量明显高于野生型。通过对黄酮类化合物合成途径的终产物花色素苷含量进行测定，转基因DfCHS植株中花色素苷的含量明显高于野生型中的含量。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 香鳞毛蕨研究概述

1．1．1 香磷毛蕨的分布及生态环境

1．1．2 形态解剖学研究

1．1．3 化学成分及药理作用

1．2 黄酮类化合物的研究概况

1．2．1 黄酮类化合物的结构及分类

1．2．2 黄酮类化合物的生理活性

1．2．3 黄酮类化合物的合成途径

1．2．4 蕨类植物黄酮类化合物的研究概况

1．3 黄酮合成途径关键酶的研究进展

1．3．1 苯丙氨酸解氨酶的研究进展

1．3．2 肉桂酸4-羟化酶(C4H)的研究进展

1．3．3 查尔酮合成酶(CHS)的研究进展

1．3．4 查尔酮异构酶(CHI)的研究进展

1．3．5黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的研究进展

1．4 本研究的目的、意义和技术路线

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料及其处理

2．1．1 试验材料

2．1．2 材料的组织培养

2．2 菌株和载体

2．2．1 大肠杆菌菌株

2．2．2 农杆菌菌株

2．2．3 载体

2．3 主要仪器

2．4 主要药品及试剂

2．4．1 限制性内切酶

2．4．2 分子量标准

2．4．3 抗生素配置

2．4．4 培养基配置

2．4．5 其他常用试剂

2．5 黄酮合成关键酶基因的转录组数据筛选

2．5．1 关键酶基因的筛选

2．5．2 关键酶基因的电子克隆

2．6 黄酮合成关键酶基因片段的克隆及序列分析

2．6．1 香鳞毛蕨总RNA的提取

2．6．2 RNA纯度及浓度检测

2．6．3 香鳞毛蕨cDNA的合成

2．6．4 DfCHI基因保守片段的克隆及序列分析

2．6．5 DfF3H基因保守片段的克隆及序列分析

2．6．6 DfPAL基因家族的筛选及序列分析

2．6．7 DfC4H基因保守片段的克隆及序列分析

2．7 黄酮合成关键酶基因在不同条件下的表达特性分析

2．7．1 试验材料的处理

2．7．2 香鳞毛蕨RNA的提取

2．7．3 香鳞毛蕨cDNA的合成

2．7．4 DfPAL基因家族及DfC4H实时荧光定量PCR测定

2．8 黄酮合成关键酶基因cDNA全长的克隆及序列分析

2．8．1 DfPAL3基因cDNA全长的获得

2．8．2 DfPAL3基因ORF的生物信息学分析

2．8．3 DfC4H基因cDNA全长的获得

2．8．4 DfC4H基因ORF的生物信息学分析

2．9 植物表达载体构建及农杆菌转化

2．9．1 DfC4H开放阅读框的获得

2．9．2 DfC4H植物表达载体的构建

2．9．3 DfCHS开放阅读框的获得

2．9．4 DfCHS植物表达载体的构建

2．9．5 拟南芥的种植

2．9．6 农杆菌菌液的制备

2．9．7 对拟南芥的遗传转化

2．10 转基因拟南芥的检测及功能分析

2．10．1 转基因拟南芥的筛选

2．10．2 转基因拟南芥的PCR鉴定

2．10．3 转基因拟南芥第一代谢产物的测定

2．10．4 转基因拟南芥生理指标的测定

3 结果与分析

3．1 基因片段的转录组数据筛选

3．1．1 关键酶基因的筛选

3．1．2 关键酶基因的电子克隆

3．2 黄酮合成关键酶基因片段的克隆及序列分析

3．2．1 DfCHI基因片段的克隆及序列分析

3．2．2 DfF3H基因片段的克隆及序列分析

3．2．3 DfPAL基因家族的筛选及序列分析

3．2．4 DfC4H基因保守片段的克隆与序列分析

3．3 黄酮合成关键酶基因在不同条件下的表达特性分析

3．3．1 DfPAL基因家族及DfC4H的组织特异性表达

3．3．2 DfPAL基因家族及DfC4H在低温条件下的表达分析

3．3．3 DfPAL基因家族及DfC4H在高温条件下的表达分析

3．3．4 DfPAL基因家族及DfC4H在紫外条件下的表达分析

3．4 DfPAL3基因cDNA全长的获得

3．4．1 DfPAL3基因片段的克隆

3．4．2 通过3’RACE获得DfPAL3基因的3’端序列

3．4．3 通过5’RACE获得DfPAL3基因的5’端序列

3．4．4 DfeAL3基因cDNA全长的克隆

3．5 DfPAL3基因的生物信息学分析

3．5．1 DfPAL3基因的cDNA序列及特征

3．5．2 DfPAL3基因ORF序列Blastx分析

3．5．3 DfPAL3蛋白一级结构的预测及分析

3．5．4 DfPAL3蛋白二级结构的预测及分析

3．5．5 DfPAL3蛋白功能区的预测及定位分析

3．5．6 DfPAL3蛋白的信号肽预测

3．5．7 DfPAL3基因编码蛋白质的蛋白跨膜区分析

3．5．8 DfPAL3基因编码蛋白质的卷曲螺旋预测

3．5．9 DfPAL3基因编码蛋白质的糖基化位点分析

3．5．10 DfPALS基因编码蛋白质的磷酸化位点预测

3．5．11 DfPML3基因编码蛋白三级结构的预测及分析

3．5．12 DfPAL3基因编码蛋白质的多重比较及系统进化树构建

3．6 DfC4H基因CDNA全长的获得

3．6．1 DfC4H基因保守片段的克隆与序列分析

3．6．2 通过3’RACE获得DfC4H基因的3’端序列

3．6．3 通过5'RACE获得DfC4H基因的5’端序列

3．6．4 DfC4H基因ORF的克隆

3．7 DfC4H基因的生物信息学分析

3．7．1 DfC4H基因的cDNA序列及特征

3．7．2 DfC4H基因ORF序列Blastx分析

3．7．3 DfC4H蛋白一级结构的预测及分析

3．7．4 DfC4H蛋白二级结构的预测及分析

3．7．5 DfC4H蛋白功能区的预测及定位分析

3．7．6 DfC4H基因编码氨基酸的信号肽预测

3．7．7 DfC4H基因编码氨基酸的蛋白跨膜区分析

3．7．8 DfC4H基因编码氨基酸的卷曲螺旋预测

3．7．9 DfC4H基因编码氨基酸的糖基化位点分析

3．7．10 DfC4H基因编码氨基酸的磷酸化位点预测

3．7．11 DfC4H基因编码蛋白三级结构的预测及分析

3．7．12 DfC4H基因编码氨基酸序列多重比较及系统进化树构建

3．8 植物表达载体的构建及农杆菌转化

3．8．1 DfC4H基因开放阅读框的克隆及表达载体的构建

3．8．2 pBI121-DfC4H植物表达载体的双酶切鉴定

3．8．3 pBI121-DfC4H重组质粒导入根癌农杆菌

3．8．4 DfCHS基因开放阅读框的克隆

3．8．5 pBI121-DfCHS载体的构建

3．8．6 pBI121-DfCHS的双酶切鉴定

3．8．7 pBI121-DfCHS重组质粒导入根癌农杆菌

3．9 转基因拟南芥的检测及功能分析

3．9．1 转基因拟南芥的筛选

3．9．2 转基因拟南芥的PCR鉴定

3．9．3 转基因拟南芥的第一代谢产物的测定

3．9．4 转基因拟南芥的生理指标的测定

4．讨论

4．1 香鳞毛蕨黄酮合成关键酶基因的选择

4．2 黄酮合成关键酶基因保守序列的克隆及分析

4．3 不同温度及紫外处理对基因表达特性的影响

4．4 基因全长的获得及生物信息学分析

4．5 基因过表达植株的获得

4．6 过表达基因对代谢产物的影响

4．7 提高代谢产物含量的调控因子

5 结论

6 创新点

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文