水稻内生细菌的分离及促生功能研究和几株新菌的多相分类

摘要

本研究以湖南祁阳农田系统国家野外科学研究站长期稻-稻-紫云英、稻-稻-油菜、稻-稻-黑麦草、稻-稻-冬闲四种绿肥轮作下的水稻种子、根为材料，采用可培养方法对水稻种子、根中的内生细菌进行分离，研究微生物的多样性，并筛选出具有促生功能的菌株。对分离出的潜在新菌进行多相分类。
　　通过稀释涂布平板法对不同绿肥轮作下的水稻种子、根内生细菌进行分离、纯化，然后利用细菌通用引物，对纯化后的菌株进行基于16S rDNA基因序列的PCR扩增。结果水稻种子中共获得246株内生细菌，其中稻-稻-冬闲、稻-稻-紫云英、稻-稻-油菜、稻-稻-黑麦草轮作下分离出的内生细菌分别为42、102、58、44株，它们分别属于23个属中的39个种，其中以假单胞菌（Pseudomonas）数目最多，属于优势菌;水稻根中共获得360株内生细菌，其中稻-稻-冬闲、稻-稻-紫云英、稻-稻-油菜、稻-稻-黑麦草轮作下分离出的内生细菌分别为55、173、72、60株，它们分别属于31个属中的50个种，其中以草螺旋属（HerbaspiriUum）数目最多，属于优势菌。
　　用大米汤、阿须贝、TSA和1/4R2A四种不同的培养基对水稻种子内生细菌进行分离，结果表明稻-稻-冬闲轮作下内生细菌的数量为大米汤＞阿须贝＞TSA＞1/4R2A，稻-稻-紫云英轮作下为1/4R2A＞TSA＞阿须贝＞大米汤，稻-稻-油菜轮作下为1/4R2A＞阿须贝＞大米汤＞TSA，稻-稻-黑麦草轮作下为1/4R2A＞大米汤＞阿须贝＞TSA。
　　通过定性或定量的研究方法对挑选出的179株优势种进行促生功能初筛，共筛选出具有溶解无机磷活性的有80株，具有分泌铁载体能力的有64株，具有分泌IAA功能的有93株。对40株初筛结果较好的菌株进行复筛，结果显示，具有抗串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的有28株，固氮功能的有5株。对17株经初筛和复筛结果中促生功能较好的菌株进行大试管促生能力评价，结果表明，17株经过促生菌株处理的水稻株高、鲜重和干重都高于对照组，经过SPSS软件对其差异性分析，有4株水稻的株高、鲜重和干重和对照组有显著的差异。并对这些促生功能明显的菌株进行下一步的田间试验。
　　对从稻-稻-紫云英轮作下的水稻根内、水稻根际土中和松嫩平原盐碱地土壤中分离出的四株潜在新种ZYY112，1ZS3-5，NEAU-ST5-5和NEAU-ST5-21，从表型特征、化学分类特征和基因型特征方面进行多项分类鉴定。其中包括形态学特征，生理学特征，生化特征，营养要求，脂肪酸分析，呼吸醌分析，极性脂分析，16S rDNA和持家基因序列的系统发育分析，基因组DNA G+Cmol％，DNA-DNA杂交同源性等。结果表明菌株ZYY112属于Novosphingobium属，菌株1ZS3-5属于Paenibacillus属，NEAU-ST5-5和NEAU-ST5-21均属于Pseudomonas属。并且它们与其各自属中最近缘种存在着显著的差异，最后确定它们为各自属中的新成员。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 绿肥还田研究进展

1．2 植物内生细菌的研究

1．2．1 植物内生细菌概述

1．2．2 植物内生细菌的研究方法

1．3 微生物多样性的研究

1．4 植物内生细菌促生功能多样性

1．4．1 直接促进植物生长功能

1．4．2 间接促进植物生长功能

1．5 微生物多相分类研究方法

1．6 研究的目的与意义

1．7 研究内容

1．8 课题来源

2 材料与方法

2．1 不同绿肥轮作下水稻种子、根内生细菌分离鉴定实验材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 促生功能菌株筛选实验材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 功能菌株促生实验

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．4 四株新类群菌株多相分类鉴定实验材料与方法

2．4．1 实验材料

2．4．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 水稻种子、根内生细菌多样性

3．1．1 不同绿肥轮作下分离到的水稻种子、根内生细菌数量多样性

3．1．2 不同绿肥轮作下水稻种子、根内生细菌种属多样性

3．1．3 不同绿肥轮作下水稻种子、根内生细菌种属分布情况

3．1．4 不同培养基条件下分离出水稻种子内生细菌的多样性

3．1．5 水稻种子、根内生细菌序列测定与系统发育分析

3．2 促生功能菌株初筛

3．2．1 溶解无机磷能力测定

3．2．2 产铁载体能力测定

3．2．3 分泌IAA能力测定

3．3 促生功能菌株复筛

3．3．1 对病原菌的拮抗作用

3．3．2 固氮酶活能力测定

3．4 功能菌株筛选结果

3．5 大试管促生能力评价

3．6 四株潜在新菌的多项分类

3．6．1 表型特征

3．6．2 化学分类特征

3．6．3 基因型特征

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文