水稻稻瘟病拮抗细菌的筛选和抗菌物质的初步提取

摘要

稻瘟病（Magnaporthe oryzae）是黑龙江省水稻栽培中的主要病害，严重影响水稻的产量和品质。生物防治以其无污染，无残留等优点已成为绿色食品水稻生产中防治水稻稻瘟病的的主要方法。但生物防治从总体上看还存在一些问题，如菌株的作用方式单一、防治效果不稳定、生产和使用技术不完善等。所以筛选出一株高效广谱的生防菌，通过与低毒农药混配不仅可解决以上问题，而且能改善化学防治产生的抗药性、污染残留等现象，进而有效提高病害的防治效果。
　　本文利用平板划线法从黑龙江16个市县的水稻根系土壤中分离出579株细菌，以稻瘟病菌为指示菌，通过平板对峙法进行初筛，打孔法复筛，筛选出23株抑菌率在50％以上的拮抗细菌，占分离总株数的4％;其中一株抑菌效果最显著、稳定，复筛抑菌率为73.44％，将其命名为Sc2。抗菌谱试验结果显示，Sc2对所有供试病原菌抑菌率均在60％以上，说明Sc2具有高效、广谱的抑菌效果，有作为生防菌株的潜能。
　　经鉴定初步确定Sc2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;单因素实验和正交试验结果表明，Sc2发酵液最佳成分为:酵母膏0.5％，葡萄糖0.3％，Nacl0.5％，优化后Sc2发酵液对水稻稻瘟病菌的抑菌直径提高到35.64mm，抑菌率达79.20％。
　　Sc2发酵上清液对稻瘟病菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用，随着稀释倍数的增加，抑制率逐渐下降。其中1倍、10倍、20倍稀释液对稻瘟病菌的孢子萌发抑制率均为100％;1倍、10倍稀释液对稻瘟病菌丝生长的抑制率均在80％以上;40倍稀释液对稻瘟病菌孢子萌发的24 h抑制率及菌丝生长的7d抑制率仍达60％以上。
　　Sc2与三环唑有较好的相容性，在三环唑浓度为4000μg/mL的培养基上依然能够生长。对水稻苗期稻瘟病室内盆栽试验结果表明，Sc2发酵液与三环唑配比的预防作用要显著高于治疗作用，其中发病前喷施Sc2与三环唑1∶2的复配液对水稻稻瘟病苗瘟防治作用最好，防效达到90.33％，效果优于其它各处理。
　　Sc2发酵液处理后的种子，发芽率与对照相比均无显著性差异，说明Sc2发酵液对水稻种子萌发无抑制作用。无论是盆栽还是水培条件，Sc2发酵液均能显著提高水稻苗的生长。特别是对水稻根部生长的促进作用最显著，盆栽和水培条件下，5倍稀释液对根干重的增长率分别为175％和137.9％。
　　硫酸铵40％-50％（不包含40％）饱和度时，Sc2抗菌粗蛋白对水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，抑菌率为63.02％。通过胰蛋白酶和蛋白酶K处理后，粗提物抑菌活性分别下降4.30％和9.34％，表明其对蛋白酶。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 稻瘟病研究概况

1．1．1 稻瘟病的危害

1．1．2 病原

1．1．3 发病规律

1．1．4 防治方法

1．2 芽孢杆菌及其应用概况研究

1．2．1 生防细菌的研究慨况

1．2．2 芽孢杆菌研究概况

1．2．3 芽孢杆菌生防机制

1．3 芽孢杆菌抗菌活性物质的研究概况

1．3．1 芽孢杆菌抗菌活性物质的主要种类

1．3．2 芽孢杆菌抗菌活性物质的研究

1．4 生物防治与化学防治协同作用

1．4．1 生物防治与化学防治协同增效的作用机制

1．4．2 生物防治与化学防治协同作用的研究概况

1．4．3 生物防治与化学防治协同作用所产生的问题

1．5 研究目的与意义

2．材料与方法

2．1 稻瘟病菌拮抗细菌的分离与筛选

2．1．1 材料

2．1．2 试验方法

2．2 拮抗细菌的鉴定和最佳发酵液的研究

2．2．1 材料

2．2．2 试验方法

2．3 拮抗细菌对稻瘟病菌的抑制作用

2．3．1 试验材料

2．3．2 试验方法

2．4 拮抗细菌发酵液对稻瘟病防效的测定

2．4．1 试验材料

2．4．2 试验方法

2．5 拮抗细菌发酵液对水稻的促生作用

2．5．1 试验方法

2．6 拮抗细菌抑菌活性物质的粗提取

2．6．1 拮抗细菌抑菌活性成分的粗提取及活性检测

2．6．2 抗菌粗提物对蛋白酶稳定性的测定

2．7 数据处理与分析

3 结果与分析

3．1 稻瘟病拮抗细菌的筛选

3．2 拮抗细菌Sc2的鉴定及适宜发酵液的研究

3．2．1 形态鉴定

3．2．2 生理生化鉴定

3．2．3 分子鉴定

3．2．4 拮抗细菌Sc2适宜发酵液的研究

3．3 Sc2对稻瘟病菌的抑制作用

3．3．1 Sc2发酵上清液对稻瘟病菌分生孢子萌发的影响

3．3．2 Sc2发酵上清液对稻瘟病菌菌丝生长的影响

3．4 Sc2发酵液对水稻稻瘟病防效的测定

3．4．1 Sc2发酵液与三环唑相容性测定

3．4．2 Sc2发酵液与三环唑对稻瘟病菌的协同防治效果

3．5 Sc2发酵液对水稻的促生作用

3．5．1 Sc2发酵液对水稻种子萌发的影响

3．5．2 拮抗细菌发酵液对水稻的促生作用

3．6 Sc2抑菌活性物质的粗提取

3．6．1 Sc2抑菌物质的提取及对稻瘟病菌菌丝生长的影响

3．6．2 Sc2抑菌粗提物对蛋白酶稳定性的测定

4 讨论

4．1 关于稻瘟病拮抗细菌的筛选

4．2 关于拮抗细菌最适发酵条件的筛选

4．3 关于拮抗细菌对离体叶片防效的测定

4．4 关于拮抗细菌Sc2作为根际促生菌的潜力

4．5 关于拮抗细菌Sc2与三环唑协同防治稻瘟病的研究

4．6 关于拮抗细菌Sc2抗菌粗提物的研究

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文