高海拔土壤中稻瘟病拮抗细菌的筛选及其抗菌机理研究

摘要

为了获得对水稻稻瘟病菌具有拮抗效应的细菌菌株，我们分别从西藏采集了米拉山口、工布江达、达孜县、比日神山、墨脱县龙达村、贡嘎县以及日喀则等七个地区的地表5-10cm层的土壤，通过土壤梯度稀释和平板涂布法分离获得了共计232株形态各异的细菌菌株，通过平板对峙法分离筛选出了一株对稻瘟病原菌具有较强抑制作用的细菌，通过对该菌株的生理生化测定和分子测定确定了其类型，并对其适宜的碳源、氮源和环境条件等进行了探究，同时对其发酵适宜的环境因素和营养因素进行了研究，在此基础上探索了发酵液的稳定性和拮抗菌及其发酵液对病原菌菌丝和孢子的影响。另外，对发酵液中有效抑菌物质进行了简单的提取，并完成了对拮抗菌的抑制机理的初步探索。主要结论如下：
　　从西藏地区的7个不同地点采集的土样中共分离出232株形态有差异的细菌，通过初筛和平板对峙法进行复筛，发现贡嘎县土样中有一株具有较强的对稻瘟病有拮抗作用的细菌菌株，相对抑菌效率达到了90％。通过传统的生理生化鉴定与16rsDNA分子鉴定相结合的方法，确定该菌株为枯草芽孢杆菌属Bacillus atrophaeus。
　　通过检测OD600和相对抑菌效率，确定了该拮抗菌最适生长碳源和氮源分别为蔗糖和酵母粉，最适生长温度为30℃-35℃，生长最适初始pH为7-8。拮抗菌发酵条件最适碳源为乳糖，最适氮源为谷氨酸钠，最适发酵温度为30℃-35℃，为节约能源，可选用30℃，最适发酵初始pH为8。有机氮源的利用效率高于无机氮源，二糖的利用效率高于单糖和多糖。
　　利用不同方法对发酵液中抑菌物质进行粗提取，发现有效抑菌物质类型并不单一，可能包括大分子蛋白，低分子肽类等，并且具有较强的极性。通过对发酵液稳定性检测，发现抑菌物质对酸碱环境，紫外辐照不敏感。在40-80℃范围内，对温度敏感性不高，抑菌效率无显著变化，当温度高于100℃时，相对抑菌效率显著降低。较好的稳定性决定了该拮抗菌具有开发为生物农药的潜力。
　　拮抗菌发酵液对稻瘟病菌丝的生长和孢子的萌发具有抑制作用。抑菌物质对病原菌细胞膜造成破坏，增大细胞膜通透性，导致胞内电解质、蛋白质以及糖外泄，阻碍了菌丝的营养供应，抑制了病原菌的发育。经处理的菌丝发生扭曲变形，原生质凝结，膨大断裂。经处理的孢子一方面被延迟了萌发时间，一方面极大的缩短了芽长长度。最终导致了病原菌生长受到抑制。拮抗菌一方面通过菌体与病原菌发生营养和空间位点上的竞争，一方面在发酵过程中分泌抑菌物质，综合作用抑制病原菌生长。但具体抑菌物质的种类以及生防制剂制备方式仍需要进一步的探索和研究。

目录

声明

第一章 绪论

1.1稻瘟病的危害

1.2病原菌

1.3稻瘟病的发病原因及条件

1.4稻瘟病的防治

1.5生防菌的作用机制研究

1.6本研究的目的和意义

第二章 水稻稻瘟病拮抗菌的分离鉴定及其特性

2.1材料与设备

2.2试验方法

2.3试验结果与分析

2.4小结与讨论

第三章 稻瘟病拮抗菌的发酵条件优化及其稳定性研究

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3试验结果与分析

3.4小结与讨论

第四章 拮抗菌发酵产物的理化性质和抗菌机理研究

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3试验结果

4.4小结与讨论

第五章 总结

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文