抑致病菌益生菌菌株及其胞外多糖抗TGEV作用的比较分析

摘要

本研究选择猪粪便中初步分离的50株益生菌菌株，分别通过检测抑菌活性、抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性、耐酸和耐胆盐活性，筛选出具有综合优势的益生菌菌株4株，并经16S rRNA深入鉴定，它们分别为食淀粉乳酸杆菌（Lactobacillus amylovorus）、屎肠球菌（Enterococcus Faecium）和两株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在上述基础上，本研究进一步应用这4株益生菌菌株，提取各株胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）并检测其抗TGEV活性，分析比较各株益生菌培养上清的抗病毒活性与其胞外多糖的相关性，为探究益生菌抗TGEV的成分提供理论依据。
　　在益生菌抑菌特性的检测中，选用临床上最常见的两种病原菌:以大肠杆菌O78（Escherichia coli O78）为代表的革兰氏阴性菌和以致病性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为代表的革兰氏阳性菌。采用牛津杯法（琼脂扩散法）来筛选具有抑制致病菌的益生菌菌株，确保益生菌具有对抗两株病原菌的特性。结果表明:50株益生菌均有不同程度的抑菌作用，对两株不同致病菌也存在抑制作用的差异，同一株益生菌抑制大肠杆菌O78作用强，但对致病性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表现为很强和/或很弱的抑制作用，缺乏规律性;不同益生菌菌株分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用差异性显著(P＜0.05)，存在着菌株差异性。
　　在益生菌抗病毒特性的检测中，选用仔猪病毒性腹泻常见病毒——猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为研究对象，以ST细胞建立体外TGEV感染细胞模型，采用MTT比色法检测益生菌的抗TGEV活性。检测结果表明:50株益生菌均对TGEV具有不同程度抑制作用，抑制程度不一;其中，具有显著差异抗病毒活性的菌株为S1、S4、S32、S45(p＜0.05)。
　　为进一步评价这50株益生菌培养上清和其中4株益生菌胞外多糖的抗病毒特性，运用新城疫病毒的HA试验，检测了对NDV血凝特性的影响，结果表明:50株菌株中有13株菌株具有抗NDV血凝作用;S1和S4菌株的培养上清具有抗NDV血凝的作用，S32、S45、S15、S35跟生理盐水和MRS对照组相比无差别，不具有抗NDV血凝的作用，上述菌株所提取的胞外多糖均不具有抗NDV血凝的作用。
　　为保证益生菌在胃肠道内能够存活、模拟胃肠道环境以及潜在的应用价值，对具有综合优势的菌株，选用pH2.0的MRS培养以及含0.3％猪胆盐的MRS液体培养基分别处理益生菌1h和4h，同时设置正常MRS培养基作为对照组，检测益生菌的耐酸、耐胆盐特性。最终筛选出4株具有耐酸耐胆盐特性、抑制病原菌和抗病毒活性的益生菌:S1、S4、S32、S45。经过16S rRNA鉴定，S1为食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus），S4为屎肠球菌（Enterococcus Faecium），S32和S45为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
　　对上述4株益生菌菌株分别提取其培养上清中的胞外多糖，同样利用MTT比色法检测益生菌胞外多糖的抗TGEV活性。结果表明:上述4株益生菌菌株所提取胞外多糖均具有抗TGEV活性，不同益生菌株的胞外多糖抗TGEV效果不同，同一种属益生菌所分离的胞外多糖的抗病毒活性也不同。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 益生菌概述

1．1．1 益生菌的定义

1．1．2 益生菌的分类

1．2 益生菌的作用与应用

1．2．1 益生菌的抑菌作用

1．2．2 益生菌的抗病毒作用

1．2．3 对肠道菌群的影响

1．2．4 促进肠道屏障的完整性

1．2．5 宿主免疫反应的调节

1．2．6 益生菌的应用

1．3 益生菌胞外多糖的作用

1．3．1益生菌胞外多糖的免疫调节作用

1．3．2 益生菌胞外多糖的抗病毒作用

1．4 猪传染性胃肠炎病毒概述

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料和仪器

2．1．1 菌株、细胞和病毒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要培养基及溶液

2．2 试验方法

2．2．1 猪肠道益生菌的分离和纯化

2．2．2 益生菌抑菌效果的检测

2．2．3 益生菌抗猪传染性胃肠炎病毒活性的测定

2．2．4 抗猪传染性胃肠炎病毒的益生菌的耐酸、耐胆盐评价

2．2．5 菌株的鉴定

2．2．6 益生菌胞外多糖的提取

2．2．7 益生菌抗NDV血凝试验

2．2．8 数据分析

3 结果

3．1 猪肠道益生菌的分离纯化

3．2 益生菌抑菌效果的评价

3．3 益生菌抗病毒活性的测定

3．3．1 ST细胞

3．3．2 猪传染性胃肠炎病毒的毒力测定

3．3．3 益生菌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的测定

3．4 具有综合优势益生菌株的耐酸、耐胆盐的测定

3．5 菌株鉴定

3．5．1 益生菌菌落形态学观察

3．5．2 16S rRNA鉴定

3．6 益生菌胞外多糖的提取以及抗病毒活性测定

3．7 益生菌抗NDV血凝试验

4 讨论

4．1 益生菌菌株的筛选及鉴定

4．2 益生菌对不同致病菌的抑菌作用比较

4．3 益生菌菌株抗病毒活性

4．4 抗TGEV益生菌的抗NDV血凝效果

4．5 益生菌菌株胞外多糖的抗病毒作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文