氧化-内质网应激通路在缺硒引起鸡肝脏凋亡中的作用

摘要

肝脏是硒缺乏的靶器官之一，日粮中硒缺乏会导致肝脏损伤和氧化应激的发生。内质网应激和氧化应激在多种应激引起的损伤中都发挥作用，且内质网应激在氧化应激引起的凋亡中扮演重要角色。肝脏疾病和肝脏损伤最根本的中心环节是肝细胞凋亡。既往研究认为肝细胞凋亡主要通过两条信号通路介导:一条是死亡受体通路;另一条是线粒体通路。但最近的研究发现内质网应激信号通路亦介导细胞凋亡，但是对缺硒引起鸟类肝脏凋亡的作用机制知之甚少。本试验研究的目的是阐明氧化—内质网应激通路在缺硒引起鸡肝脏凋亡中的作用。
　　本试验中180只一日龄的海蓝白蛋鸡被随机分成低硒组和正常组两组，其中低硒组日粮硒含量为0.033mg/kg，正常组日粮硒含量为0.2mg/kg。在15d、25d、35d、45d、55d和65d时剖杀采取肝脏组织。用试剂盒检测CAT活性、H2O2产量和抑制·OH的能力，实时定量PCR法检测内质网应激相关基因(GRP78、GRP94、ATF4、ATF6、Caspase12)和凋亡相关基因（Caspase3和Bcl-2），免疫印迹法检测GRP78、GRP94、Caspase3、Bcl-2和 CHOP的蛋白含量，HE染色观察鸡肝脏的病理结构，电子显微镜观察肝细胞凋亡的超显微结构，TUNEL法检测肝细胞的凋亡率。研究结果表明:
　　(1)低硒组中CAT活性和抑制·OH的能力下降，H2O2的产量升高，表明鸡肝脏中发生了氧化应激。
　　(2)低硒组中内质网应激相关基因(GRP78、GRP94、ATF4、ATF6、Caspase12)的mRNA水平升高，其中GRP78、GRP94和CHOP的蛋白水平也升高，此外，内质网发生损伤，证明缺硒导致鸡肝组织发生了内质网应激。
　　(3)低硒组肝组织中Caspase3的mRNA和蛋白表达升高，Bcl-2的表达下降，超微结构观察到肝细胞典型的凋亡特征，TUNEL检测发现肝脏中凋亡细胞的数量随着试验进行逐渐升高，表明缺硒诱发了鸡肝细胞凋亡。
　　综上所述，氧化—内质网应激信号通路参与了缺硒引起的鸡肝脏凋亡这一过程。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 缺硒与肝脏疾病

1．2 缺硒与细胞凋亡

1．3 缺硒与氧化应激

1．4 氧化应激与内质网应激的关系

1．5 内质网应激对肝细胞凋亡的影响

1．6 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 主要仪器和试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 动物饲养和试验设计

2．3 检测内容与方法

2．3．1 组织显微结构的观察

2．3．2 组织超微微结构的观察

2．3．3 肝脏组织细胞凋亡的TUNEL检测

2．3．4 肝脏组织氧化应激指标的检测

2．3．5 肝脏组织中GRP78、GRP94、ATF4、ATF6、Caspase12、Caspase3和Bcl-2 mRNA表达水平的检测

2．3．6 肝脏组织中GRP78、CHOP、Caspase3和Bcl-2蛋白表达水平的检测

2．4 试验数据统计学分析

3 结果与分析

3．1 肝脏组织显微结构观察结果

3．2 肝脏细胞超微结构观察结果

3．3 硒缺乏诱导肝脏细胞凋亡的检测结果(TUNEL法)

3．4 氧化应激相关指标的检测结果

3．4．1 肝脏组织中抑制·OH能力的检测结果

3．4．2 肝脏组织中H2O2产量的检测结果

3．4．3 肝脏组织中CAT活性的检测结果

3．5 肝脏组织中GRP78、GRP94、ATF4、ATF6、Caspase12、Caspase3和Bcl-2 mRNA表达水平的检测结果

3．5．1 肝脏组织中GRP78 mRNA表达水平的检测结果

3．5．2 肝脏组织中GRP94 mRNA表达水平的检测结果

3．5．3 肝脏组织中ATF4 mRNA表达水平的检测结果

3．5．4 肝脏组织中ATF6 mRNA表达水平的检测结果

3．5．5 肝脏组织中Caspase12 mRNA表达水平的检测结果

3．5．6 肝脏组织中Caspase3 mRNA表达水平的检测结果

3．5．7 肝脏组织中Bcl-2 mRNA表达水平的检测结果

3．6 肝脏组织中GRP78、CHOP、Caspase3和Bcl-2蛋白表达水平的检测结果

4 讨论

4．1 缺硒对肝脏细胞凋亡的影响

4．2 缺硒对肝脏组织氧化应激的影响

4．2．1 缺硒对肝脏中·OH的影响

4．2．2 缺硒对肝脏中H2O2和CAT的影响

4．3 内质网应激对肝脏细胞凋亡的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文