转基因动物中外源基因整合位点的分析

摘要

转基因动物在农业、食品、医药、环境等各个方面都具有广阔的发展前景。自从1974年Jaenisch等把猿猴空泡病毒(SV40)的DNA注射入小鼠胚泡，培养出具有猿猴空泡病毒转基因小鼠，转基因动物的研究飞速发展，到目前为止，已经涌现出了许许多多的转基因动植物。在人们沉浸于转基因动植物带来的巨大成功时候，转基因动植物的安全问题也更加凸显。2012年9月21日，有一篇名为“吃了两年转基因谷物过半实验鼠长肿瘤”的报道给人们敲响了警钟。我们不应盲目地进行转基因动物的生产及应用，必须做好对转基因动植物安全问题的检测，避免转基因研究过程中造成危害。安全检测包括多个方面，首先，是基因水平的检测，包括检测外源基因在宿主基因组中的整合位点及其对宿主基因组表达的影响;其次，是转录水平的检测，检测外源基因及宿主基因mRNA表达情况;第三，是翻译水平的检测，测量外源基因及宿主染色体基因的蛋白表达情况;第四，便是对模式动植物实际应用过程中的检测，来评价转基因动植物是否真正安全。我们选择本实验室转牛MYF6基因鼠及内蒙古大学转秀丽线虫FAT-1基因牛作为研究对象。
　　实验通过TAIL-PCR、hiTAIL-PCR及改进的hiTAIL-PCR方法对本实验室三只转基因鼠及转基因牛进行外源基因整合位点检测，应用荧光定量PCR对整合位点附近基因mRNA表达情况进行研究，为转基因动物的安全评价提供依据。
　　1、在转基因鼠A中得到一个特异性的条带，将扩增所得片段的测序结果与GenBank中已知的鼠核酸序列进行比对分析之后发现外源基因在宿主基因组的整合过程中发生了重组质粒的首尾相连。
　　2、在转基因鼠B中得到一个特异性序列，即重组质粒整合到鼠12号染色体43264229之后且同源率为99％，其中有6bp的碱基为重组质粒序列与小鼠基因组序列共有，证明外源基因在宿主基因组以同源重组的方式整合。
　　3、不论在转基因鼠中还是转基因牛中都有发现重组质粒不是在酶切位点断开，而是在其它的任意碱基处随机断裂。
　　4、在转基因鼠C发现重组质粒的3'端插入小鼠2号染色体第171864372个碱基之前，重组质粒与染色体之间不是直接连接，二者之间插入了未知序列;在14号染色体第13858398个碱基之前有重组质粒插入，质粒的断裂位点在酶切位点之后第四位碱基处，随机插入到14号染色体;在重组质粒酶切位点下游设计特异性引物扩增到转基因牛中重组质粒插入到16号染色体第13904955碱基位置之前的整合序列。这些结果证明外源基因的整合是多位点随机整合，整合过程中可产生未知序列。
　　5、在整合位点的检测过程中，发现转基因鼠A及转基因牛中的一些结果中，宿主染色体的序列两端各连接了一段未知序列，证明外源基因整合入宿主染色体，可导致宿主染色体序列的断裂。
　　6、在进行整合位点检测时，经常检测到未知序列的情况，我们推测有可能是外源基因污染或者是由宿主在外源基因整合过程中基因断裂的小碱基片段随机组合形成。
　　7、通过荧光定量PCR研究IMMP2L基因mRNA水平表达，证明外源基因的整合会对整合位点附近的宿主基因表达造成影响。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 转基因动物国内外研究现状

1．2 MYF6基因

1．3 FAT-1基因

1．4 外源基因整合位点的检测技术

1．4．1 荧光原位杂交

1．4．2 个体基因组文库筛选法

1．4．3 反向PCR

1．4．4 接头PCR

1．4．5 锚定PCR

1．4．6 随机引物PCR

1．5 基因组测序技术

1．5．1 第一代测序技术

1．5．2 第二代测序技术

1．5．3 第三代测序技术

1．6 荧光定量PCR技术

1．7 本试验研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要器材

2．1．3 实验试剂

2．1．4 分析软件

2．1．5 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 外源基因整合位点的检测

2．2．2 整合位点附近宿主基因表达量检测

2．2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 外源基因整合位点检测结果

3．1．1 整合过程中重组质粒连接情况

3．1．2 整合过程中同源重组情况

3．1．3 整合过程中重组质粒断裂情况

3．1．4 在重组质粒酶切位点下游设计特异性引物扩增结果

3．1．5 非特异性扩增的情况

3．1．6 扩增到宿主染色体、未知片段及重组质粒序列的情况

3．1．7 只扩增到重组质粒及未知序列的情况

3．1．8 只扩增到重组质粒序列的情况

3．1．9 只扩增到未知序列的情况

3．1．10 造成宿主基因组断裂的情况

3．2 荧光定量PCR检测IMMP2L表达结果

4 讨论

4．1 检测方法的调整

4．2 外源基因整合位点检测

4．2．1 整合过程中重组质粒的连接

4．2．2 整合过程中发生的同源重组

4．2．3 整合过程中重组质粒的断裂

4．2．4 在重组质粒酶切位点下游设计特异性引物扩增

4．2．5 非特异性扩增

4．2．6 扩增到宿主染色体、未知片段及重组质粒序列

4．2．7 只扩增到重组质粒和未知序列

4．2．8 只扩增到重组质粒序列

4．2．9 只扩增到未知序列

4．2．10 宿主基因组的断裂

4．3 对整合位点检测的认识

4．4 荧光定量PCR检测IMMP2L表达研究

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文