犬副流感病毒单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

摘要

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)首次于1967年从患呼吸道疾病的犬中分离获得，是犬窝咳的主要病因之一。临床表现为咳嗽、流鼻涕等呼吸道症状。当与细菌、病毒等混合感染时，可引起犬的死亡。血清学调查表明CPIV在世界各国普遍流行。现有的关于CPIV流行病学调查资料显示，在犬以及其他野生动物的血清样品中，CPIV的阳性率较高。由于CPIV长期困扰着养犬业的健康发展，所以需要一种准确、简便的诊断方法来对该病作出准确诊断。
　　CPIV的NP蛋白是核衣壳蛋白的主要成分，与病毒RNA直接结合，高度保守，在病毒感染时可引起强烈的抗体反应。通过RT-PCR扩增NP基因，并将NP基因克隆到pET-30a载体，然后转化至E.coli BL21感受态细胞，构建重组质粒pET-30a-NP，并对重组质粒进行双酶切和测序鉴定。利用IPTG对重组菌株进行诱导表达，获得重组蛋白NP。对重组蛋白NP进行纯化鉴定，SDS-PAGE的试验结果显示，重组蛋白NP的分子量与预期大小相符;Westernblot的试验结果显示，重组蛋白NP能与CPIV阳性血清发生反应。
　　使用纯化的重组NP蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，将SP2/0细胞与经过免疫鼠的脾细胞进行细胞融合。用CPIV作为包被抗原，建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，经过筛选得到3株阳性杂交瘤细胞株，能稳定分泌单克隆抗体，命名为2F1、3B9、4D11。Western blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示，3株阳性杂交瘤细胞上清均可以同CPIV发生特异性反应。将4D11杂交细胞株腹腔注射小鼠，获取腹水，测得腹水效价为1∶104。
　　本研究以CPIV作为检测抗原，以4D11单克隆抗体作为竞争抗体，建立竞争ELISA检测方法并且对试验条件进行优化，确定试验的最佳反应条件。利用已建立的竞争ELISA检测方法检测77份CPIV犬阳性血清，根据统计学方法计算得到阳性临界值为15.1％。该方法与犬细小病毒(CPV)血清、犬瘟热病毒(CDV)血清无交叉反应，表明该检测方法具有良好的特异性;批内重复试验的变异系数为1.30％～5.29％，批间变异系数为1.18％～8.55％，表明该检测方法具有较好的重复性。分别使用建立的竞争ELISA方法和血凝抑制试验对153份血清进行检测，结果显示符合率为92.16％。
　　本实验建立了CPIV抗体的竞争ELSA检测方法，优化了试验条件，为CPIV的快速诊断、流行病学的调查与免疫抗体监测提供了技术支持。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 病原学特性

1．2 主要蛋白

1．2．1 核衣壳蛋白

1．2．2 病毒包膜蛋白

1．3 病毒复制

1．3．1 吸附与进入

1．3．2 转录和翻译

1．3．3 病毒粒子的包装与释放

1．4 毒力机制

1．5 流行病学

1．6 临床症状

1．7 病理变化

1．8 临床诊断

1．8．1 病毒分离

1．8．2 免疫荧光检测

1．8．3 抗体水平检测

1．8．4 RT-PCR检测

1．9 预防与控制

1．10 目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 毒株、细胞、实验动物

2．1．2 载体、菌种

2．1．3 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 重组质粒pET-30a-NP的构建及鉴定

2．2．3 重组NP蛋白的表达、纯化、鉴定

2．2．4 CPIV-NP单克隆抗体的制备

2．2．5 犬副流感病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及应用

3 结果

3．1 重组质粒pET-30a-NP的鉴定

3．1．1 NP基因的PCR鉴定结果

3．1．2 重组质粒pET-30a-NP双酶切鉴定结果

3．2 重组NP蛋白的鉴定

3．2．1 纯化重组NP蛋白的SDS-PAGE分析

3．2．2 纯化的重组原核表达蛋白NP的western-blot分析

3．3 CPIV单克隆抗体的制备

3．3．1 间接ELISA方法的建立

3．3．2 阳性杂交瘤细胞株的获得

3．3．3 MAb的western blot鉴定

3．3．4 MAb的IFA鉴定

3．3．5 腹水效价的测定

3．4 犬副流感病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及应用

3．4．1 竞争ELISA检测方法的建立

3．4．2 阳性临界值的确定

3．4．3 特异性试验

3．4．4 重复性试验

3．4．5 临床样品的检测

4 讨论

4．1 重组NP蛋白的表达及纯化

4．2 CPIV单克隆抗体的制备

4．3 竞争ELISA检测方法的建立

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文