低温诱导栽培番茄、多毛番茄和类番茄茄的转录组分析

摘要

有些植物在低温环境下能提高自身的耐低温能力，这个现象称为低温驯化，或冷驯化。植物应对低温环境的能力是不同的，适应了温带环境的植物能够在低温环境中提高自身的耐低温能力，而起源于热带和亚热带环境的植物（如番茄）不具备耐低温能力。有研究表明，低温调控基因在植物低温应答的分子机制中起到重要的作用，而且不同植物耐受低温能力的差别很可能与低温调控基因有关系。此外，也有研究表明，可变剪接(AS)在拟南芥、水稻和玉米等植物中有着广泛的功能，同时也与这些植物胁迫应答有重要关系。MicroRNA（miRNA，或小RNA）也发现与植物器官发育和非生物胁迫应答有关。栽培番茄、多毛番茄和类番茄茄是近缘物种，但它们的耐低温能力却有很大的差别，多毛番茄和类番茄茄比栽培番茄具有更强的耐低温能力，但其耐低温分子机制目前并不清楚。
　　在本研究中，以栽培番茄（glamor）作为不耐低温材料的对照，利用转录组测序方法，初步解析了多毛番茄(LA1777)和类番茄茄(LA2408)两种野生番茄的耐低温分子机制。利用高通量测序仪，我们在三个材料，三个低温胁迫时间点（0小时、1小时和12小时）中，总共得到了大于200，000，000个测序读长(Reads)，对这些Reads做了基因组定位，研究了差异表达基因(DEG)、可变剪接(AS)和MicroRNA（miRNA，或小RNA）等信息。我们对没有基因组参考的多毛番茄和类番茄茄，进行了基因序列的体外从头组装，结果分别得到了68，051和59，286个非重复基因片段，且保证所有组装基因片段的长度都大于200bp。
　　差异表达基因的结果表明，栽培番茄、多毛番茄和类番茄茄这三个材料，在低温胁迫下，包括1小时和12小时后，都改变了基因的表达模式。在栽培番茄（不耐低温材料对照）中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有1，256和3，350个基因上调（其中804个基因是两个时间点共有）;有856和3，022个基因下调（其中339个基因是两个时间点共有）。在多毛番茄中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有1，725和2，940个基因上调（其中722个基因是两个时间点共有）;有1，967和3，126个基因下调（其中1，000个基因是两个时间点共有）。在类番茄茄中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有617和1，928个基因上调（其中136个基因是两个时间点共有）;有1，066和1，171个基因下调（其中185个基因是两个时间点共有）。同时，我们挑选了一些差异表达基因进行荧光定量PCR验证，证明测序结果可靠，可用于进一步分析。
　　为了研究多毛番茄的耐低温分子机制，我们利用DAVID分析平台对多毛番茄和栽培番茄低温调控基因进行了功能聚类分析。在1小时低温胁迫后，多毛番茄和栽培番茄低温调控基因都在“非生物刺激应答”这一类中显示出高度富集。但是，与栽培番茄相比，多毛番茄低温调控基因在“叶绿体相关”、“运输肽”、“三角状五肽重复”、“苯丙烷代谢过程”、“黄酮代谢过程”和“氨基酸衍生物的生物合成过程”等类别中富集程度更高，而在“细胞壁代谢”、“几丁质等有机物应答”和“DNA结合的WRKY”等类别中，相比栽培番茄的富集程度更低。在12小时低温胁迫后，多毛番茄和栽培番茄低温调控基因都在“有机物应答”和“激素刺激应答”这一类中显示出高度富集。但是，与栽培番茄相比，多毛番茄低温调控基因在“UDP-葡糖醛酸基转移酶”等类别中富集程度更低。数据表明，冷耐受型番茄和冷敏感型番茄在低温应答的分子机制方面存在很大差别。
　　与类番茄茄不同，栽培番茄和多毛番茄与公布的番茄基因组序列相似度都大于70％，我们对其可以进行可变剪接分析。结果表明，在栽培番茄和多毛番茄中，共识别得到172，910个可变剪接，其中包含75，885个新可变剪接。在栽培番茄三个时间点中，分别识别得到105，663、109，251和102，316个可变剪接，其中包含21，548，25，492，22，870个新可变剪接;在多毛番茄三个时间点中，分别识别得到106，690、104，440和105，323个可变剪接，其中包含20，909，19，957和23，179个新可变剪接。其中，发现内含子保留是可变剪接的主要类型。对低温胁迫相关的可变剪接进行统计，结果表明，在栽培番茄受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有131和575个可变剪接相应基因倾向于发生可变剪接;有119和152个可变剪接相应基因不倾向于发生可变剪接。在多毛番茄受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有114和606个可变剪接相应基因倾向于发生可变剪接;有122和130个可变剪接相应基因不倾向于发生可变剪接。同时，在栽培番茄受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有121和522个可变剪接相应基因上调;有110和140个可变剪接相应基因下调。在多毛番茄受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有112和553个可变剪接相应基因上调;有111和122个可变剪接相应基因下调。
　　在本研究中，还识别了总共1，041个MicroRNA（miRNA，小RNA）的候选序列和靶基因。在栽培番茄中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有14和8个MicroRNA上调;有7和6个MicroRNA下调。在多毛番茄中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有2和4个MicroRNA上调;有5和8个MicroRNA下调。在类番茄茄中，受到低温胁迫1小时和12小时后，分别有151和59个MicroRNA上调;有151和20个MicroRNA下调。同时，我们识别了MicroRNA的靶基因。根据MicroRNA与靶基因相反的表达量变化，结果表明，“sly-miR396a-靶基因Solyc07g041640.2”，“sly-miR5303b-靶基因Solyc09g009550.2”，“sly-miR162-靶基因Solyc01g080500.2”，“sly-miR172a-靶基因Solyc03g044300.2”，“unconservative_ SL2.50ch00_3860-靶基因 c50426.graph_c0”，“sly-miR156a-靶基因c49736.graph_c0”等MicroRNA可能是低温应答相关“MicroRNA-靶基因通路”。结论:基因表达，MicroRNA和可变剪接的差异可能是栽培番茄、多毛番茄和类番茄茄耐低温能力差别的重要原因。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的和意义

1．2 文献综述

1．2．1 植物低温应答分子机制研究进展

1．2．2 多毛番茄和类番茄茄

1．2．3 高通量测序技术

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种

2．1．3 分子生物学试剂和生化试剂

2．1．4 培养基的配置

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 生理生化指标测定

2．2．2 测序与数据分析

2．2．3 荧光定量PCR检测

3 结果与分析

3．1 表型与生理

3．2 转录组测序

3．2．1 高通量测序

3．2．2 全基因组定位分析

3．3 差异表达基因识别

3．3．1 样品相关性分析

3．3．2 荧光定量PCR验证

3．3．3 差异表达基因识别

3．4 低温应答分子机制分析

3．4．1 栽培番茄和多毛番茄低温应答分子机制分析

3．4．2 类番茄茄低温应答分子机制分析

3．4．3 转录因子的低温调控

3．4．4 植物激素生物合成与信号相关低温调控基因

3．5 低温应答可变剪接的识别

3．5．1 栽培番茄和多毛番茄新可变剪接的识别

3．5．2 栽培番茄和多毛番茄低温应答可变剪接的识别

3．5．3 低温应答可变剪接基因的功能聚类分析

3．6 栽培番茄和多毛番茄的SNP分析

3．7 MicroRNA识别

3．7．1 高通量测序

3．7．2 新MicroRNA的识别

3．7．3 MicroRNA差异表达与低温应答MicroRNA的识别

3．7．4 MicroRNA靶基因的识别

3．7．5 低温应答MicroRNA-靶基因通路识别

4 讨论

4．1 低温应答基因识别

4．2 低温应答可变剪接识别

4．3 低温应答MicroRNA识别

5 结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文