石竹中稀有内生放线菌分类学鉴定及抗菌活性初步探究

摘要

植物内生放线菌是定殖于植物组织中不会扰乱植物的生长发育的一类放线菌。虽然同样是存活于植物体内，但植物内生放线菌却并非病原菌。实验表明，很多内生菌有益于植物的生长繁殖。这是因为内生旅线菌是一类产生多种活性次级代谢产物的原核微生物，这些次级代谢产物能够抑制病原菌的繁殖，促进植物生长，从而提高植物的存活率。植物内生放线菌也因此受到各国微生物学家，生态学家，农业专家们的青睐。其产生的活性物质可广泛应用于制药业,农业,化工业，畜牧业等行业。石竹，又称瞿麦，在中国被用作药用植物已有近千年的历史。石竹能合成多种活性天然物质。目前石竹内生放线菌的研究还尚属空白。因此研究石竹内生放线菌意义非凡。
　　本实验致力于调查中国传统药用植物石竹内生放线菌多样性和分布情况，与此同时对其中的内生放线菌进行抗病原真菌细菌实验，对其产活性物质潜力进行评估。从四株不同生境条件下的石竹根茎叶部位共分离到64株内生放线菌。研究发现，不同植物组织，不同筛选培养基，分离情况也有所不同。石竹内根部内生放线菌数量最多。HV培养基和高氏培养基分离的内生放线菌最多。其中21株内生放线菌对病原真菌表现出抑制抗性。其中5株内生菌对8种以上病原菌表现出活性作用。7株内生放线菌的平均抑制率在15％左右。有5株内生菌发酵液对病原细菌表现出抗性作用。在这五种内生放线菌中，有三株内生放线菌(CY23、CY60、CY64)浸提沉淀物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性，平均抑制率在10％左右。
　　从64株内生放线菌中选出形态较为少见的四株菌(CY10，CY12，CY13，CY18)，对其进行16sRNA测序分析，测序结果表明CY10属于小单孢菌属(Micromonospora)，CY13是隶属于链孢囊菌属(Streptosporangium)，CY12和CY18都属于球孢囊菌属（Sphaerisporangium)。经鉴定NEAU-CY18T为分离自石竹根部的球孢囊菌属新种，再对其进行多相分类学鉴定。NEAU-CY18T在气生菌丝上长有球形光滑的孢子囊，孢子不游动。细胞壁氨基酸成分为内消旋-二氨基庚二酸（meso-diaminopimelic acid）。全细胞水解糖为马杜拉糖(madurose)，半乳糖(galactose)，核糖（ribose），葡萄糖(glucose)，甘露糖（mannose）。磷酸类脂组成为双磷脂酰甘油(DPG)，磷脂酰甲基乙醇胺(PME)，磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)，羟基磷脂酰乙醇胺(OH-PME)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰甘露糖肌醇(PIM)和未知磷酸类脂(PL)。主要甲基萘醌成分为MK-9(H4)，MK-9(H2)和MK-9(H6)。主要脂肪酸为C17∶010-methyl，iso-C16∶0 andC16∶0。EzTaxon-e网站分析显示NEAU-CY18T与S.cinnabarinum JCM3291T(98.9％)和S.melleum JCM13064T相似度最高，分别为98.9％和98.3％。最大似然建树法以97％的阈值支持这一亲缘进化关系，邻位连接建树法也支持这种亲缘关系。由于NEAU-CY18T的表型特征与其余两株球孢囊菌属有差异，加之三个菌株之间较低的DNA关联度，因此可以认为NEAU-CY18T为球孢囊菌株的新菌种。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物内生放线菌概况

1．2 植物内生放线菌的研究进展

1．2．1 植物内生放线菌的多样性研究

1．2．2 植物内生放线菌代谢产物研究

1．2．3 植物内生放线菌所面临的问题和对策

1．3 植物内生放线菌的应用价值

1．3．1 生物防治剂

1．3．2 植物生长促进剂

1．4 石竹内生放线菌

1．4．1 石竹植物概述及其药用价值

1．4．2 石竹内生菌研究概况

1．5 球孢囊茵属(Sphaerisporangium)概述

1．6 研究意义及内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1 1 供试石竹植物样品

2．1．2 供试菌株

2．2 供试试剂及实验仪器

2．2．1 供试试剂

2．2．2 试验仪器

2．3 培养基配方及配制方法

2．3．1 筛选培养基

2．3．2 纯化培养基

2．3．3 发酵培养基

2．3．4 活性测试培养基

2．3．5 菌丝体液体培养基

2．3．6 大肠杆菌培养基

2．3．7 形态观察培养基

2．3．8 生理生化培养基

2．4 石竹内生放线菌的筛选分离及纯化

2．4．1 石竹样品的采集及预处理

2．4．2 石竹内生放线菌的分离与纯化

2．4．3 表面消毒效果检测

2．4．4 植物内生放线菌的保藏

2．4．5 内生放线菌的初步分类

2．5 稀有内生放线菌的分类学鉴定

2．5．1 形态和培养特征鉴定

2．5．2 生理生化特征鉴定

2．5．3 化学分类鉴定

2．5．4 分子水平鉴定

2．6 石竹内生放线菌抗菌活性检测

2．6．1 内生放线菌单菌落对病原真菌活性检测

2．6．2 放线茵的发酵及其前处理

2．6．3 发酵液粗体物的抗菌活性

3 结果与讨论

3．1 石竹样品内生放线菌分离和初步鉴定

3．2 菌株NEAU-CY18T的多相分类学鉴定

3．2．1 16S rDNA的基因测序及系统进化分析

3．2．2 形态及培养特征

3．2．3 生理生化特征

3．2．4 化学分类鉴定

3．2．5 (G+C)mol％测定结果

3．2．6 DNA同源性测定结果

3．3 抗菌活性测定

3．3．1 抑真菌活性测定

3．3．2 放线菌发酵液对细菌的抑制活性

3．4 讨论

3．5 展望

4 结论

4．1 结论

4．2 本实验创新点

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文