肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

摘要

IGF2（胰岛素样生长因子2）是一种蛋白质，它由67个氨基酸残基组成，在个体的生长发育过程中起重要作用，是骨骼肌生长发育的重要调控因子。近年来，对IGF2的研究逐渐深入，但是通过过表达IGF2的方式来培育高产、生长发育快的优质肉牛方面的报道较少。本研究旨在获得带有高效特异性启动子的IGF2表达载体，研究其对牛骨骼肌卫星细胞(简称MDSCs)增殖的影响。欲提高IGF2在肌肉组织中的表达效率，首先需要获得一个含有IGF2的高效表达的载体，其中启动子的选择是一个重要因素。目前，巨细胞病毒(CMV)启动子是外源基因在真核细胞中表达常选用的启动子之一，该启动子非常高效，但其几乎不具有组织特异性，出于转基因生物安全方面的考虑，不能将其应用于转基因肉牛的生产中。所以，选取特异高效的启动子对于外源基因在真核细胞中的表达是必要的，本研究应用的是实验室前期构建的具有特异性且活性相对较高的三种启动子:Desminpro(300)是牛结蛋白基因启动子，大小为300bp，活性较高，它启动基因表达的能力约为人的骨骼肌α-actin启动子与肌酸激酶启动子的2倍左右;CMV-MyoGpro是MyoG基因启动子之前连接了一段CMV增强子序列，在C2C12细胞中CMV-MyoGpro复合启动子的转录活性较牛MyoG启动子提高了9倍左右，达到了强启动子CMV启动子的72％，在牛骨骼肌卫星细胞中，CMV增强子提高转录活性的效果更明显;MyoGpro-double是含有两个拷贝数调控元件的MyoG启动子片段，其转录活性显著高于普通MyoG基因启动子，约为MyoG基因启动子转录活性的3.8倍，三种启动子都具有较高的活性和较好的肌肉特异性。本研究获得了含上述三种有肌肉特异性启动子的IGF2真核表达载体，通过细胞转染及IGF2表达量检测，筛选出具有较高活性和较强肌肉特异性的IGF2表达载体，并探索其对牛骨骼肌卫星细胞增殖的调控作用。
　　主要研究结果如下:
　　(1)肌肉特异性的IGF2表达载体的构建
　　本实验根据GeneBank中公布的牛IGF2基因序列，设计引物，应用PCR方法，以MDSCs基因组DNA为模板扩增牛IGF2基因CDS序列，并利用实验室前期构建的desminpro，CMV-MyoGpro，MyoGpro-Double三种肌肉特异性启动子构建了pGL3-desminpro-IGF2，pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2，pGL3-MyoGpro-Double-IGF2三种带有肌肉特异性启动子的IGF2真核表达载体;
　　(2)表达载体活性与特异性的筛选
　　瞬时转染MDSCs和牛胎儿成纤维细胞，RT-PCR检测比较三种启动子启动IGF2基因在肌肉中的表达效率，结果表明pGL3-desminpro-IGF2是相对高效，并具有肌肉特异性的表达载体;
　　(3) EdU检测pGL3-desminpro-IGF2转入细胞后对MDSCs增殖的影响
　　pGL3-desminpro-IGF2载体转入MDSCs后，EDU检测证明pGL3-desminpro-IGF2能够提高细胞增殖率，与对照相比，增殖率为27.31％;
　　(4)检测pGL3-desminpro-IGF2转入细胞后细胞内相关基因的表达变化
　　RT-PCR检测pGL3-desminpro-IGF2转染后细胞周期相关基因的表达变化发现IGF2是通过下调CDKs蛋白抑制因子P27的表达，上调CDK6的表达而加速细胞增殖的;为了进一步研究IGF2的作用机理，我们通过向MDSCs中添加生长因子IGF2作用后进行Western blot检测，结果表明该基因可能是通过调节AKT磷酸化过程而加速细胞增殖的。
　　本研究获得了能够在MDSCs中高效特异性表达的真核表达载体pGL3-desminpro-IGF2，其在MDSCs中能够高效特异性表达并能显著提高成肌细胞的增殖率，为生产肌肉产量高的转基因肉牛奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 IGFS家族简介

1．2 IGF2基因的研究进展

1．2．1 IGF2基因的结构

1．2．2 IGF2基因的功能

1．2．3 IGF2基因信号通路

1．3 启动子的结构与功能概述

1．4 组织特异性启动子概况

1．4．1 组织特异性启动子研究进展

1．4．2 肌肉特异性启动子CMV-MyoGpro概况

1．4．3 肌肉特异性启动子MyoGpro-double概况

1．4．4 肌肉特异性启动子Desminpro概况

1．5 研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 主要实验材料

2．1．1 菌株、质粒及细胞

2．1．2 工具酶、试剂盒和其他试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的培养

2．2．2 牛IGF2基因的克隆

2．2．3 肌肉特异性启动子IGF2表达载体的构建

2．2．4 重组质粒瞬时转染牛骨骼肌卫星细胞和牛胎儿成纤维细胞

2．2．5 EDU检测重组质粒对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

2．2．6 RT-PCR检测三种重组质粒转染细胞后相关基因的表达变化

2．2．7 Western Blot检测转染后相关基因蛋白的表达变化

3 结果与分析

3．1 肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建

3．1．1 牛IGF2基因CDS区的克隆与测序

3．1．2 中间载体pcDNA3．1(+)-IGF2酶切鉴定

3．1．3 肌肉特异性IGF2表达载体的构建及双酶切鉴定

3．2 表达载体活性与特异性的筛选

3．2．1 RT-PCR检测三种重组质粒转染细胞后IGF2的表达变化

3．3 真核表达载体pGL3-desminpro-IGF2对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

3．3．1 EdU检测转染pGL3-desminpro-IGF2后对细胞增殖的影响

3．3．2 RT-PCR检测转染pGL3-desminpro-IGF2后细胞周期相关基因的表达变化

3．3．3 Western Blot检测下游基因AKT和P-AKT蛋白的表达

4 讨论

4．1 载体的选择

4．2 组织特异性启动子功能的研究

4．3 转染方法及条件的选择

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文