链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU 1069-3次级代谢产物及抗蚜虫活性的研究

摘要

由于微生物的次级代谢产物拥有潜在的生物活性以及对非目标生物和人类具有较低的毒性，因此逐渐获得了越来越多的人的关注。现在一些微生物的次级代谢产物，如阿维菌素、米尔贝霉素等现在已经被商业化生产，并被认为是在动物健康和在农业病虫害控制等方面中使用的最为广泛的药物。在我们寻找新型的天然杀虫剂和抗寄生虫药物的过程中，有两个大环内酯类的化合物、三个米尔贝霉素类的化合物、以及六个与多拉菌素的有相类似结构的化合物从Streptomyces avermitilis NEAU1069的发酵液中被分离出来。为了发现更多具有不同种类的活性的化合物，我们对菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069使用了紫外诱变的育种方法因此获得了突变的菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069-3，我们通过将野生菌株与突变型菌株进行对比发现两者的次生代谢产物的HPLC图谱有显著的差别。因此说明伴随着突变菌株的发酵过程中有新的化合物的合成。为了探究突变菌株中次生代谢产物的多样性，于是我们对其所产生的次级代谢产物的分离提取进程、结构解析和活性测定，进行了具体的描述。
　　本研究对突变菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069-3进行30L的放大发酵，收集其发酵的液体并对其发酵的液体进行前处理、HP-20树脂柱的吸附与洗脱过程、通过硅胶和凝胶的柱层析、高效液相等现代的分离方法和技术手段进行更进一步分离与纯化，最终经过我们的分离方法和技术手段后获得到10个次级代谢产物，其中有2个化合物经过鉴定后确定其为新型化合物。利用现代波谱分析方法(1H-NMR，13C-NMR，紫外，旋光度，红外，质谱，1H-1HCOSY，HMBC，HMQC)对化合物结构进行鉴定，其中化合物23，24-didehydro-13α-hydroxymilbemycin A3(1)和24，30-didehydro-13α-hydroxy milbemycin A3(2)是新化合物，其余8个为已知化合物，分别为:13β-hydroxyMilbemycin D(3)，13β-hydroxy Milbemycin A4(4)，13β-hydroxy Milbemycin A3(5),13α,24-dihydroxy Milbemycin A4(6),13β,30-dihydroxyMilbemycin A4(7),13β-hydroxy-14,15-epoxyMilbemycin A4(8),13β-hydroxy-5-oxo-5-deoxyMilbemycin A4(9), Milbemycin A3(10)。最终，我们决定对其中2个新型的化合物进行了抗朱砂叶螨和抗蚜虫活性的测试。最后两个新化合物对朱砂叶螨表现出较弱的活性，而对菜蚜表现出比较好的活性，因此在这里我们重点描述了抗蚜虫活性。菜蚜，从十字花科蔬菜上收集未施过药剂的带有蚜虫的叶片，所收集的叶片中不应该含有若蚜和有翅蚜，使蚜虫大小基本相同、密度适中，于温室内培养。本实验所选用的试验方法是叶碟浸虫浸液的方法。分别将化合物1、2和米尔贝霉素(其色谱的纯度可以达到95％，其中两者各占的比例为A3/A4=30/70)配制成0.5％的制剂，添加水将其稀释成为0.1、0.25、0.5、1、2个浓度梯度的药液，置于烧杯中备用。将含有试虫的叶片在配制好的药液中浸泡5秒钟后，拿出叶片后置于底部铺垫有保湿的滤纸的培养皿（其直径为9cm）中后待其自然风干。每个处理以相同的实验操作进行3次重复，每一个重复实验选择50头供试虫，并置于养虫室种恒温饲养，将清水作为对照。在室内的条件下饲养24h后检查各浓度药液处理后的死亡虫体的个数，并采用几率值法计算致死浓度LC50(mg·L-1)值。其中化合物1，2的LC50分别为0.4987和0.5694，数据表明化合物1，2具有较好的杀虫活性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 微生物次生代谢产物简介

1．2 微生物次生代谢产物筛选的方法

1．2．1 抗微生物活性筛选法

1．2．2 化学筛选法

1．3 米尔贝霉素的简介

1．4 本课题研究的意义和内容

1．4．1 本文研究的意义

1．4．2 本文研究的主要内容

1．5 课题来源

2 实验材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验仪器设备及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的培养基及发酵

2．3 分离提取

2．3．1 发酵液的前处理

2．3．2 薄层层析(TLC检测)

2．4 提取分离步骤

2．5 结构鉴定

2．6 结果与分析

2．6．1 化合物归纳

2．6．2 结构鉴定

2．7 化合物的活性评价

3 讨论

4 结论

致谢

参考文献

附录

缩略语说明

攻读硕士学位期间发表的学术论文