接种菌剂对牛粪堆肥硝化和反硝化细菌群落影响的研究

摘要

将具有木质纤维素降解能力的菌剂，接种到以牛粪和水稻秸秆为材料的堆肥中，通过测定温度、pH值、C/N、种子发芽率、NH4+-N、NO3--N相关指标，考察了接种菌剂堆肥和自然堆肥腐熟情况。采用传统培养与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术相结合的方法，研究了接种菌剂对牛粪堆肥中硝化、反硝化细菌数量及群落结构组成和多样性的影响，为进一步探讨硝化、反硝化细菌在堆肥氮素循环中的作用提供了理论基础。主要研究结果如下:
　　(1)整个堆肥过程共持续45d，两组堆肥都经历了升温、高温、降温和腐熟阶段。菌剂堆肥最高温度为66℃高于自然堆肥的最高温度59℃，高温期分别持续13d和9d，表明接种菌剂可提高堆肥温度，延长高温期，同时pH值、C/N、种子发芽率、NH4+-N和NO3--N含量变化表明接种菌剂有利于微生物生长，促进堆肥腐熟，达到无害化标准。
　　(2)接种菌剂使堆肥中可培养的硝化细菌数量多于自然堆肥，反硝化细菌数量少于自然堆肥。硝化和反硝化细菌数量与NH4+-N成负相关关系，与NO3--N成显著正相关关系(P＜0.05）;菌剂堆肥相关系数大于自然堆肥。
　　(3)接种菌剂对amoA基因标记的氨氧化细菌多样性及群落结构组成产生一定影响。和自然堆肥相比，菌剂堆肥中氨氧化细菌种类更加丰富。自然堆肥中亚硝化螺菌属(Nitrosospira)为优势种群，而菌剂堆肥中增加了新的类群，分别为亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。
　　(4)接种菌剂对nirS型反硝化细菌群落多样性无明显影响，而使narG, napA，nirK和nosZ型发生改变。和自然堆肥相比，narG多样性指数在堆肥升温阶段较低，降温阶段较高;菌剂堆肥napA和nosZ种类更加丰富，各时期多样性指数都大于自然堆肥;NirK型反硝化细菌多样性在菌剂堆肥中减少。
　　(5)接种菌剂对nirS型反硝化群落结构组成无影响，对narG, napA，nirK和nosZ影响较大。自然堆肥narG型主要类群为发硫菌属(Thiothrix)，而接种菌剂导致一些新的未培养类群产生，使原优势发硫菌属(Thiothrix)数量和所占比例减小;假单胞菌属(Pseudomonas)和某些未培养细菌是自然堆肥NapA型反硝化细菌群落的优势菌属，菌剂堆肥除了含有这些类群外还出现了新的反硝化类群，分别属于红细菌属(Rhodobacter)和生丝微菌属(Hyphomicrobium); NirK在菌剂堆肥后期检测到与红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)同源性较高的反硝化细菌，但未检测到自然堆肥降温时期存在的无色杆菌属(Achromobacter)和一些未培养细菌，且使原自然堆肥的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)，根瘤菌属(Rhizobium)，中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)，副球菌属(Paracoccus)和假单胞菌属(Pseudomonas)表现出消失再出现的变化现象;自然堆肥nosZ型反硝化细菌包括假单胞菌属(Pseudomonas)，产碱菌属(Alcaligenes)和无色杆菌属(Achromobacter)，其中，假单胞菌属(Pseudomonas)为优势菌群，而菌剂堆肥中检测出自然堆肥所没有的新类群，包括盐单胞菌属(Halomonas)，固氮螺菌属(Azospirillum)，副球菌属(Paracoccus)，草螺菌属(Herbaspirillum)和产碱菌属(Alcaligenes)。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 农业固体废物的概述

1．2 堆肥技术的研究

1．2．1 堆肥定义

1．2．2 厌氧堆肥

1．2．3 好氧堆肥

1．2．4 堆肥腐熟度的判定

1．3 堆肥中添加菌剂的研究进展

1．4 硝化作用

1．4．1 硝化作用机理

1．4．2 氨单加氧酶基因(amoA)

1．5 反硝化作用

1．5．1 反硝化作用机理

1．5．2 反硝化作用的酶与编码基因

1．6 堆肥微生物多样性的研究方法

1．6．1 传统研究方法

1．6．2 分子生态学研究方法

1．7 本文的研究目的和意义

1．8 本实验的技术路线图

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 堆肥材料

2．1．2 外源菌剂

2．2 实验设计

2．2．1 堆肥设置

2．2．2 样品采集

2．2．3 测定内容及方法

2．3 堆肥微生物群落结构及多样性的研究方法

2．3．1 样品总DNA的提取

2．3．2 粗提DNA的纯化

2．3．3 功能基因的PCR扩增

2．3．4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

2．3．5 DGGE图谱分析

2．3．6 DGGE条带测序

2．3．7 系统发育分析

2．3．8 统计分析

3 结果与分析

3．1 堆肥物理指标的变化

3．1．1 堆肥温度变化

3．1．2 堆肥水分含量变化

3．2 堆肥化学指标的变化

3．2．1 pH值变化

3．2．2 C／N变化

3．2．3 NH4+-N含量变化

3．2．4 NO3--N含量变化

3．3 堆肥生物指标的变化

3．3．1 种子发芽率变化

3．4 硝化细菌和反硝化细菌数量变化

3．4．1 硝化细菌数量变化

3．4．2 反硝化细菌数量变化

3．5 硝化和反硝化细菌与理化因素相关性分析

3．6 堆肥微生物群落结构及多样性的分析

3．6．1 基因组DNA的提取、纯化

3．6．2 功能基因的PCR扩增

3．6．3 DGGE图谱及系统发育分析

4 讨论

4．1 菌剂对硝化细菌数量的影响

4．2 菌剂对反硝化细菌数量的影响

4．3 菌剂对amoA基因多样性的影响

4．4 菌剂对narG基因多样性的影响

4．5 菌剂对napA基因多样性的影响

4．6 菌剂对nirK和nirS基因多样性的影响

4．7 菌剂对nosZ基因多样性的影响

4．8 菌剂对氨氧化细菌群落结构的影响

4．9 菌剂对反硝化细菌群落结构的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文