耳叶水苋对ALS抑制剂的抗性及其ALS基因表达研究

摘要

耳叶水苋在稻田的危害日趋严重，苄嘧磺隆的防治效果越来越差。该草对ALS抑制剂类除草剂的交互抗性水平国内外未见报道。本论文测定不同耳叶水苋生物型对4种ALS抑制剂的交互抗性，并利用荧光定量PCR技术研究了耳叶水苋的抗性分子机制，研究结果如下:
　　1、盆栽法测定结果表明，苄嘧磺隆对五种耳叶水苋生物型HZ001（浙江）、NB0143-05（浙江）、JX110（浙江）、JS039（江苏）、AH014（安徽）的鲜重抑制50％剂量（ED50值）分别为0.18、3.16、12.20、8.02和1.50gai/ha，生物型NB0143-05、JX110、JS039、AH014对苄嘧磺隆的抗性指数分别为44.63、67.90、17.59和8.37。五氟磺草胺、双草醚、咪唑乙烟酸对敏感生物型HZ001的ED50值分别为0.16、0.19和0.24，NB0143-05、JX110、JS039、AH014等四种生物型对五氟磺草胺的抗性指数分别为5.43、4.96、3.73和4.55，对双草醚的抗性指数分别为4.60、5.05、2.17和3.63，对咪唑乙烟酸的抗性水平分别为6.45、2.60、4.16和1.96。这表明，浙江、江苏和安徽的NB0143-05、JX110、JS039、AH014四种耳叶水苋生物型对苄嘧磺隆产生了中高水平抗性，且对三唑嘧啶类除草剂五氟磺草胺都产生了低水平交互抗性;对于嘧啶硫代苯甲酸酯类的双草醚，NB0143-05、JX110和AH014产生了低水平交互抗性;NB0143-05和JS039产生了低水平交互抗性。这是国内外耳叶水苋抗苄嘧磺隆生物型对其他ALS抑制剂交互抗性的首次报道。
　　2、本研究获得浙江、江苏省稻田HZ001，NB0143-05，JS039和JX110四种耳叶水苋生物型ALS的全长序列，长度为2235bp，编码667个氨基酸。耳叶水苋三种抗性生物型的ALS基因第93位的亮氨酸(CTC)都被脯氨酸取代(CCC)，但该突变位点不是ALS酶结合域氨基酸残基与除草剂的结合位点。未见其保守区突变。
　　3、本文采用实时荧光定量PCR技术，以β-actin为内参基因，对耳叶水苋抗苄嘧磺隆生物型NB0143-05和敏感生物型HZ001在mRNA水平上进行分析。结果表明，耳叶水苋幼苗在3-4叶期进行苄嘧磺隆(0.1gai/ha)茎叶处理后第2、4、6d，生物型HZ001的ALS表达量分别是对照的1.23、2.74和2.41倍，生物型NB0143-05的ALS表达量分别是对照的1.83、4.45和2.72倍。这表明，耳叶水苋幼苗经苄嘧磺隆处理后ALS表达量逐渐增加，4d达到最大峰值，然后逐步降低。药后4天抗性生物型NB0143-05的ALS表达量是敏感生物型HZ001的1.86倍。ALS表达量增加可能是浙江省稻田耳叶水苋抗性生物型NB0143-05对苄嘧磺隆等除草剂产生抗性和交互抗性的重要原因，这是国内外耳叶水苋抗苄嘧磺隆生物型ALS基因表达量增加的首次报道。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 稻田杂草的发生、危害与治理概况

1．1．1 稻田杂草的种类及其危害

1．1．2 稻田耳叶水苋的发生与危害

1．1．3 稻田杂草的综合治理

1．2 杂草对除草剂的抗性研究进展

1．2．1 杂草抗药性的发展概况

1．2．2 杂草对除草剂的交互抗性与多抗性

1．2．3 杂草的抗药性机制

1．2．4 抗药性杂草治理

1．3 实时荧光定量PCR技术与杂草抗药性研究

1．3．1 实时荧光定量PCR的简介

1．3．2 实时荧光定量PCR技术与杂草抗药性机理研究

1．4 本论文研究目的与意义

1．5 本研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 耳叶水苋对ALS抑制齐怕勺交互抗性测定

2．2．1 供试药剂

2．2．2 抗性测定

2．2．3 数据处理方法

2．3 耳叶水苋抗性生物型与敏感生物型ALS基因DNA序列分析

2．3．1 供试耳叶水苋的培养

2．3．2 菌株与载体

2．3．3 主要仪器设备

2．3．4 常用培养基和溶液配制

2．3．5 耳叶水苋总RNA的提取

2．3．6 耳叶水苋总RNA的检测

2．3．7 耳叶水苋总RNA的电泳检测

2．3．8 耳叶水苋cDNA第一链的合成

2．3．9 常规PCR引物的设计与合成

2．3．10 耳叶水苋ALS基因中间片段的扩增

2．3．11 RACE法扩增耳叶水苋目的基因cDNA末端

2．3．12 耳叶水苋ALS基因全序列分析

2．4 耳叶水苋抗性与敏感性生物型ALS基因表达的差异研究

2．4．1 供试药剂及生化试剂

2．4．2 供试植物

2．4．3 主要仪器

2．4．4 RNA的提取及反转录

2．4．5 内参基因与目的基因的引物设计

2．4．6 内参基因与目的基因的常规PCR验证

2．4．7 内参基因与目的基因的融解曲线分析和引物的扩增效率验证

2．4．8 耳叶水苋不同生物型ALS基因的表达差异分析

3 结果与分析

3．1 耳叶水苋对四种ALS抑制剂交互抗性的测定

3．2 耳叶水苋抗性与敏感生物型ALS基因的DNA序列分析

3．2．1 耳叶水苋总RNA的纯度与完整性分析

3．2．2 耳叶水苋ALS基因保守片段的扩增和序列分析

3．2．3 耳叶水苋ALS基因cDNA 5’端RACE法扩增

3．2．4 耳叶水苋ALS基因cDNA 3’端RACE法扩增

3．2．5 耳叶水苋ALS基因全序列的获得与分析

3．3 耳叶水苋抗性与敏感性生物型ALS基因差异表达

3．3．1 荧光定量PCR中内参基因的克隆与鉴定

3．3．2 荧光定量PCR中目的基因与内参基因引物的设计与验证

3．3．3 目的基因与内参基因的融解曲线分析与扩增效率验证

3．3．4 苄嘧磺隆抗性与敏感耳叶水苋生物型在ALS基因表达的差异分析

4 讨论

4．1 耳叶水苋不同生物型对4种ALS抑制剂的交互抗性

4．2 耳叶水苋不同生物型ALS基因的DNA序列分析

4．3 实时荧光定量PCR内参基因的选择

4．4 耳叶水苋对苄嘧磺隆的抗性与ALS酶过量表达的相关性

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文