醋氨酚诱导小鼠急性药物性肝损伤中HNF-1调节GSTA1表达分析

摘要

药物在使用过程中由于其本身或代谢产物会所导致肝脏的损伤，也可能由于患者体质对药物的敏感性比较强烈易导致肝脏损伤。由于醋氨酚（APAP）普遍存在于市面上各种解热镇痛药中，使其成为药物性肝损伤比较理想并具有实际应用意义的实验模型。谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)是有机体内生物转化中最重要的Ⅱ相代谢酶之一，主要作用是防止细胞受到氧化损伤，亦能抵抗癌变反应，其对外来毒性物质和活性氧的解毒作用已经成为一种重要的抗氧化应激的细胞机制。肝细胞核因子-1（HNF-1）是一类在肝脏中表达较多的调节因子，能够调节肝细胞基因特异性表达，其分子结构上含有一段相当保守的DNA结合区，HNF-1对靶基因表达的调节正是通过该区域与各种靶基因调控区的顺式作用元件结合而实现的，从而使HNF-1在转录水平上对肝细胞的分化和代谢过程发挥着重要的作用。本课题在急性药物性肝损伤小鼠模型基础上，通过比较应用C2-神经酰胺和奥替普拉(Oltipraz)对HNF-1表达进行抑制和促进两种情况下，对肝组织中GSTA1表达的影响，明确HNF-1对GSTA1的表达的调节作用，为全面的认识GSTA1在急性药物性肝损伤中的重要作用，深入研究其作用机制提供理论基础和试验依据。
　　采用本课题组前期建立的方法复制并确认APAP诱导的急性药物性肝损伤小鼠模型，通过对血清转氨酶(ALT、AST)活性、肝组织指标(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平及肝组织中GSTA1的含量的检测来判断肝脏是否损伤，并结合肝组织病理学进行分析。在肝损伤模型基础上，血清转氨酶(ALT、AST)活性作为评价指标来筛选确定C2-神经酰胺和奥替普拉的给药途径及最适的给药浓度。将C2-神经酰胺与奥替普拉应用于肝损伤模型中，实验小鼠随机分为六组，即空白对照组（对照组）、APAP模型组（模型组）、C2-神经酰胺组（C2组）、C2-神经酰胺+APAP组（C2+AP组）、奥替普拉组（OL组）、奥替普拉+APAP组（OL+AP组），运用试剂盒检测血清转氨酶(ALT、AST)活性、肝组织指标(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平，并对肝脏进行组织病理学分析;采用RT-PCR方法检测肝组织中HNF-1和GSTA1的mRNA表达，应用Western blot方法测定肝组织中HNF-1和GSTA1的蛋白表达水平，并运用ELISA法检测肝组织中GSTA1的含量变化。综合以上研究，明确C2-神经酰胺对HNF-1的抑制作用及奥替普拉对HNF-1的促进作用，分析在C2-神经酰胺和奥替普拉双向调节HNF-1作用下对小鼠体内GSTA1的影响，确定急性药物性肝损伤中HNF-1对GSTA1表达的调节作用。
　　研究结果表明:
　　(1)给小鼠灌胃剂量为200 mg·kg-1的APAP溶液，染毒12h可成功复制小鼠急性药物性肝损伤模型。病理组织学可见细胞破损，核固缩，肝细胞索模糊不清，广泛地出现炎性细胞浸润及出血点;两种血清转氨酶活性均极显著高于对照组(p＜0.01);肝组织指标(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平均极显著改变(p＜0.01);肝脏中GSTA1含量极显著减少(p＜0.01)。
　　(2)通过给药途径和最适浓度筛选试验，确定C2-神经酰胺以120μmol·L-1浓度、奥替普拉以150μmol·L-1浓度灌胃给予小鼠。
　　(3) C2-神经酰胺和奥替普拉在肝损伤模型中应用结果显示，与对照组相比，C2组和OL组血清转氨酶、肝组织指标及病理组织学均无显著变化，说明所筛选C2-神经酰胺和奥替普拉浓度不会造成肝损伤。与模型组相比，C2+AP组两种血清转氨酶活性均极显著升高(p＜0.01)，肝组织指标呈极显著变化(p＜0.01)，病理组织学显示存在大量坏死细胞，肝细胞索模糊，炎性细胞浸润现象严重并出现大量出血点，表明C2-神经酰胺会加重APAP诱导的肝损伤;OL+AP组血清转氨酶活性则极显著降低(p＜0.01)，肝组织指标也呈极显著变化(p＜0.01)，病理组织学显示仅有少量的炎性细胞浸润及细胞核固缩，表明奥替普拉在小鼠体内能减轻APAP诱导的肝损伤。
　　(4) HNF-1的表达结果显示，与对照组相比，模型组中HNF-1的mRNA和蛋白表达水平均极显著降低(p＜0.01)，C2组和OL组均无显著变化;与模型组相比，C2+AP组中HNF-1的表达水平极显著降低(p＜0.01)而OL+AP组极显著升高(p＜0.01)。以上结果表明APAP诱导的急性药物性肝损伤会降低HNF-1的表达;在肝脏受损的情况下，C2-神经酰胺可以下调HNF-1的表达，奥替普拉可以上调其表达。
　　(5) GSTA1表达和含量的检测结果表明，与对照组相比，模型组中GSTA1的mRNA和蛋白表达水平及含量均极显著降低(p＜0.01)，C2组和OL组均无显著变化;与模型组相比，C2+AP组中GSTA1表达水平及含量均呈极显著降低(p＜0.01)而OL+AP组极显著升高(p＜0.01)。以上试验结果与HNF-1表达试验结果趋势相一致。
　　本研究成功复制小鼠急性药物性肝损伤模型，发现肝脏受损时其GSTA1含量极显著减少，表明药物性肝损伤急性期GSTA1由肝脏释放并参与机体抗氧化活动。确定C2-神经酰胺和奥替普拉的给药途径和最适给药浓度。在APAP诱导的急性药物性肝损伤中，C2-神经酰胺可使肝损伤程度加重，奥替普拉则会减轻肝损伤。在肝脏受损情况下，C2-神经酰胺可下调HNF-1的表达，奥替普拉可上调HNF-1的表达。确定HNF-1可以调节GSTA1的表达，且mRNA表达水平与蛋白表达水平的趋势相一致。HNF-1在体内通过某种基因通路调控GSTA1表达来参与机体抗氧化活动，可以起到间接保护肝脏的作用，其体分子机制有待研究。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 药物性肝损伤

1．1．1 APAP导致急性肝损伤机制

1．1．2 APAP肝毒性影响因素

1．1．3 APAP致小鼠急性肝损伤模型

1．2 肝损伤指标

1．2．1 血清转氨酶

1．2．2 超氧化物歧化酶

1．2．3 丙二醛

1．2．4 还原型谷胱甘肽

1．2．5 谷胱甘肽过氧化物酶

1．3 谷胱甘肽S转移酶A1相关研究

1．3．1 谷胱甘肽S转移酶概述

1．3．2 谷胱甘肽S转移酶A1功能

1．3．3 谷胱甘肽S转移酶A1国内外研究进展

1．4 肝细胞核因子-1研究进展

1．4．1 肝细胞核因子概述

1．4．2 肝细胞核因子-1结构与功能

1．5 HNF-1调节剂

1．5．1 C2-神经酰胺概述

1．5．2 奥替普拉概述

1．6 本研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要溶液配制

2．2 方法

2．2．1 APAP诱导小鼠急性肝损伤模型的复制

2．2．2 C2-神经酰胺与奥替普拉的给药试验

2．2．3 C2-神经酰胺与奥替普拉对模型小鼠肝脏功能的影响

2．2．4 肝损伤模型中HNF-1对GSTA1表达的调节分析

2．2．5 数据处理与统计分析

3 结果与分析

3．1 APAP诱导小鼠急性肝损伤模型的复制

3．1．1 血清转氨酶活性

3．1．2 肝组织各指标

3．1．3 肝组织GSTA1含量

3．2 C2-神经酰胺与奥替普拉的给药试验

3．2．1 给药途径

3．2．2 最适浓度

3．3 C2-神经酰胺与奥替普拉对模型小鼠肝脏功能的影响

3．3．1 血清转氨酶活性

3．3．2 肝组织各指标

3．3．3 肝脏病理组织学分析

3．4 肝损伤模型中HNF-1对GSTA1表达的调节分析

3．4．1 HNF-1对GSTA1 mRNA表达的调节

3．4．2 HNF-1对GSTA1蛋白表达的调节

3．4．3 ELISA法测定肝组织中GSTA1含量

4 讨论

4．1 APAP诱导小鼠急性肝损伤模型的复制

4．2 C2-神经酰胺与奥替普拉的给药试验

4．2．1 给药途径确定

4．2．2 最适浓度筛选

4．3 C2-神经酰胺与奥替普拉对模型小鼠肝脏功能的影响

4．4 HNF-1与GSTA1的表达分析

4．4．1 HNF-1的表达水平分析

4．4．2 GSTA1的表达水平分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文