多杀性巴氏杆菌分型分析及其感染鸡Il-1β，Il-6转录变化研究

摘要

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.multocida），能够引起人和动物共同感染，引起禽霍乱，猪萎缩性鼻炎、猪肺疫等巴氏杆菌病。巴氏杆菌病在世界各个地区均可暴发，对家畜家禽及养殖业有很大的影响。多杀性巴氏杆菌有多种血清型，不同动物来源的多杀性巴氏杆菌分离株的基因组存在差异，不同毒力菌株在基因组上也存在差异。
　　本研究以国内部分地区36株P.multicida为研究对象，利用荚膜多重PCR、脂多糖多重PCR方法进行分型鉴定，并通过多位点序列分型方法对菌株进行遗传演化分析。结果显示36株P.multicida包括A，B和D3种荚膜血清型及L1，L2，L3和L64种脂多糖基因型。禽源P.multicida以荚膜A型，脂多糖L1型为主，其中禽源菌株C48-1，Pm72-4，Pm731均为荚膜A型，脂多糖L1型。多位点序列分型技术将多其分为ST129，ST8，ST58，ST5，ST13，ST50和ST122等7种ST型，禽源P.multicida主要为ST129型。
　　20只3月龄SPF鸡随机分为4组，实验组分别感染荚膜型和脂多糖型相同的禽源多杀性巴氏杆菌菌株C48-1，50 CFU/0.1mL;Pm72-4，2×104 CFU/0.1mL; Pm731，2×109 CFU/0.1 mL各0.1mL，对照组注射0.1mL PBS。每个实验组分别在感染后剖杀死亡鸡，未死亡的鸡在14d时全部剖杀，迅速取脾脏样品用于RNA提取。采用SYBR Green染料实时荧光定景PCR检测实验组和对照组TLR4、MyD88、IL-1β和IL-6基因mRNA相对表达量的变化，通过基因表达量变化研究感染多杀性巴氏杆菌后IL-1β和IL-6转录变化。结果显示:感染菌株C48-1后5只鸡全部死亡，感染Pm72-4菌株后有2只鸡存活，感染Pm731菌株和注射PBS后5只鸡全部存活。表明C48-1菌株对SPF鸡有很强的致病性，属于强毒株;菌株Pm72-4对SPF鸡有致病性，但毒力较弱;菌株Pm731对SPF鸡不致死，属于弱毒株。荧光定量检测TLR4、MyD88、IL-1β和IL-6的表达量结果为，与对照组相比较强毒株C48-1感染后，TLR4、MyD88和IL-6的表达量均上调，且差异显著，而Pm72-4和Pm731感染组与对照组相比差异不显著;相对于对照组感染C48-1、Pm72-4和Pm731后产生IL-1β的量均上调，但差异均不显著。表明感染多杀性巴氏杆菌强毒株C48-1后激活了细胞因子IL-6，但不能激活IL-1β，感染多杀性巴氏杆菌弱毒株Pm72-4和Pm731后不能激活IL-1β和IL-6。该研究为多杀性巴氏杆菌不同菌株毒力差异的分子机制的研究提供基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 多杀性巴氏杆菌的流行病学及危害

1．1．1 多杀性巴氏杆菌的流行特点

1．1．2 多杀性巴氏杆菌的危害

1．2 多杀性巴氏杆菌病的病原学

1．2．1 多杀性巴氏杆菌的血清型

1．2．2 多杀性巴氏杆菌的生长特性与理化特性

1．3 多杀性巴氏杆菌病的发病机理

1．4 多杀性巴氏杆菌病的临床症状

1．4．1 禽霍乱

1．4．2 猪萎缩性鼻炎

1．4．3 牛出血性败血症

1．4．4 兔出血性败血症

1．5 多杀性巴氏杆菌的检测方法

1．6 多杀性巴氏杆菌的致病机制

1．7 多杀性巴氏杆菌的分型技术

1．7．1 荚膜多重PCR分型技术

1．7．2 脂多糖多重PCR分型技术

1．7．3 多位点序列分型技术

1．7．4 质粒DNA图谱分型技术

1．7．5 脉冲场凝胶电泳分型技术

1．7．6 随机扩增多态性DNA技术

1．8 TLR4／MyD88／NF-κB信号通路

1．8．1 Toll样受体

1．8．2 IL-1β和IL-6激活的分子机制

1．9 研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 菌株及试验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 溶液的配制

2．2 方法

2．2．1 多杀性巴氏杆菌分型分析

2．2．2 多杀性巴氏杆菌致病性试验

2．2．3 IL-1β，IL-6转录变化研究

3 结果

3．1 多杀性巴氏杆菌分型结果

3．1．1 多杀性巴氏杆菌鉴定结果

3．1．2 多杀性巴氏杆菌荚膜多重PCR分型结果

3．1．3 多杀性巴氏杆菌脂多糖多重PCR分型结果

3．1．4 多杀性巴氏杆菌ST型及遗传演化分析结果

3．2 多杀性巴氏杆菌致病性结果

3．2．1 C48-1，Pm731，Pm72-4菌株致病性

3．3 IL-1β，IL-6转录变化研究结果

3．3．1 PCR扩增与测序结果

3．3．2 RNA和cDNA凝胶电泳检测

3．3．3 标准曲线和溶解曲线分析结果

3．3．4 IL-1β和IL-6转录变化结果

4 讨论

4．1 多杀性巴氏杆菌分型分析

4．2 荧光定量PCR

4．3 IL-1β和IL-6转录变化分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文