生防菌NEAU-Da4对大豆内生放线菌的影响及特异放线菌鉴定

摘要

大豆疫霉可引发大豆疫霉根腐病，该病害广泛分布于全球大部分产大豆地区，是大豆主要病害之一。生防菌NEAU-Da4是一株产勃利霉素的大豆内生放线菌，对大豆疫霉病菌具有较高抑制活性。本研究以大豆内生放线菌微生态角度出发，分别以健康大豆，NEAU-Da4和大豆疫霉同时施用大豆（处理1）以及NEAU-Da4单独施用大豆（处理2）作为分离对象，通过对传统筛选方法改良，采用七种分离培养基、两种研磨方法，分别对三组植株样本的根、叶、豆荚、豆四个部位进行内生放线菌的分离。明确不同处理大豆内生放线菌群组成及差异，并对其进行抗大豆疫霉、大豆菌核和大豆根腐活性检测及特异微生物鉴定。结果如下:
　　(1)健康株及处理大豆样本中共分离得到280株内生放线菌，其中健康植株分离102株、处理1分离89株、处理2分离89株。通过对菌株形态和培养特征观察以及部分菌株16SrRNA分析，分离得到的菌株大多属于链霉菌属（Streptomyces）和小单孢菌属（Micromonospora），其中链霉菌占分离菌株的80％左右，是大豆内生放线菌优势菌群。同时也存在少量其他种类的稀有放线菌，包括处理1分离得到的白氏菌属（Baia）、植物生孢菌属（Plantactinospora）和处理2分离得到的糖霉菌属（Glycomyces）。综合分析不同部位内生放线菌，大豆植株根部菌群数目明显多于豆荚、豆叶及豆。处理1豆根中筛选稀有菌株所占比例高达38.6％，处理2达30％，两组处理均明显高于健康植株中稀有放线菌所占比例15.7％。
　　(2)生物活性检测结果显示，32株活性株均来源于大豆根部。其中，健康株内活性株所占比例为7.1％，处理1、处理2分别为22.8％和21.6％;处理1及处理2中活性株数目多于健康植株。
　　(3)运用多相分类学方法对NEAU-gxj18进行鉴定。通过16S rRNA序列分析确定该菌为高温放线菌科，与其相似性最高的菌株为Geothermomicrobium terrae YIM77562T(93.35％)。该菌株温度生长范围为20-40℃，最适生长温度为37℃。菌株NEAU-gxj18细胞壁特征氨基酸为内消旋二氨基庚二酸，磷酸类脂为双磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，未知磷脂和未知氨磷脂。细胞水解糖为半乳糖、核糖和葡萄糖，醌组主要为MK-7，脂肪酸主要为iso-C15∶0，C13∶0和iso-C17∶0，基因组G+C mol％为49.9 mol％。相关特征的比对分析确定该菌为高温放线菌科的一个新属，命名为Baia soyae。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物内生微生物群系研究概况

1．1．1 植物内生微生物群系变化的影响因素

1．1．2 植物内生微生物群系变化与植物的防御

1．2 植物内生放线菌抗病促生研究

1．2．1 植物内生放线菌调节植物生长发育

1．2．2 植物内生放线菌应用于植物病害防治

1．3 生防菌

1．3．1 生防菌

1．3．2 产勃利霉素菌株NEAU-Da4

1．4 研究的内容及课题来源

1．4．1 研究的目的意义及内容

1．4．2 课题来源

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试大豆品种

2．1．2 供试菌株

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 主要培养基及制备方法

2．3．1 分离培养基

2．3．2 纯化培养基

2．3．3 生测培养基

2．3．4 生理生化培养基

2．3．5 形态特征观察培养基

2．4 NEAU-Da4拮抗研究

2．4．1 NEAU-Da4对大豆疫霉抑菌活性测定

2．4．2 NEAU-Da4对大豆防病作用测定

2．5 无菌环境NEAU-Da4大豆根部定殖试验

2．6 NEAU-Da4对盆栽大豆内生放线菌菌群的影响

2．6．1 盆栽试验

2．6．2 大豆内生放线菌的分离和纯化

2．6．3 菌株活性检测

2．7 NEAU-gxj18的分类学鉴定

2．7．1 形态和培养特征鉴定

2．7．2 生理生化特性鉴定

2．7．3 化学分类学鉴定

2．7．4 分子水平鉴定

3 结果与分析

3．1 NEAU-Da4对大豆疫霉病菌抑菌活性测定

3．2 NEAU-Da4对大豆种子萌发的影响

3．3 NEAU-Da4对大豆植株影响

3．4 无菌环境NEAU-Da4大豆根部定殖试验

3．5 NEAU-Da4对盆栽大豆内生放线菌菌群的影响

3．5．1 菌株分离

3．5．2 NEAU-Da4对大豆内生放线菌的影响

3．5．3 不同分离方法分析

3．6 NEAU-gxj18的多相分类学鉴定结果与分析

3．6．1 16S rRNA基因测序及系统发育分析

3．6．2 形态及培养特征

3．6．3 生理生化特性

3．6．4 微生物细胞化学组分分析结果

3．6．5 菌株的(G+C)mol％含量

3．6．6 特征性核苷酸分析结果

4 讨论

4．1 高温放线菌科Baia soyae研究

4．2 施用生防菌对大豆内生放线菌影响研究

4．2．1 NEAU-Da4定殖情况分析

4．2．2 NEAU-Da4对大豆内生放线菌的影响

4．2．3 不同分离方法分析

5 结论

5．1 本研究的主要结论

5．2 本研究的主要创新

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文