组成型表达鸡致病性大肠杆菌fimA与ompC融合蛋白的重组乳酸杆菌的构建及其在鸡肠道定殖特性的研究

摘要

禽大肠杆菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大肠埃希氏菌(APEC)感染禽类引起的多种临床病型的总称。主要表现有胚胎和幼雏的死亡、败血症、气囊炎、心包炎、输卵管炎、肠炎、腹膜炎和大肠杆菌性肉芽肿等。病原性大肠埃希氏菌(E.coli)血清型众多，抗原结构复杂，给防治本病带来了困难，因此，寻求针对主要致病大肠杆菌免疫保护谱广的抗原物质，并模拟其自然感染的黏膜免疫，对该病的特异性免疫防治具有重要的实践意义。
　　为得到引发黏膜免疫并传递特异性抗原物质的活菌载体，本实验从健康鸡肠道分离乳酸杆菌进行鉴定，并对其对于肠道的粘附能力和耐药性进行了检测。通过形态、培养、生化特性鉴定以及16s rRNA鉴定，共获得了8株乳酸杆菌，其中包括3株Lactobacillus crispatus（卷曲乳杆菌）、2株Lactobacillus johnsonii（约氏乳杆菌）、2株Lactobacillus salivarius（唾液乳杆菌）和1株Lactobacillus saerimneri。8株乳酸杆菌在37℃和42℃均能良好生长;抑菌试验表明，对革兰氏阳性及阴性细菌均有一定的抑菌活性。体外粘附实验表明，8株乳酸杆菌均具有一定的粘附特性，可在肠道内定殖。抗生素敏感性实验表明8株乳酸杆菌对多种抗生素敏感。
　　在特异性抗原物质的制备上，选用APEC O1血清型的Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)作为靶抗原基因片段，以APEC基因组为模板，A1和A2为引物，经PCR扩增5'端带有ApalⅠ酶切位点和linker序列，3'端带有ApaⅠ酶切位点的528bp的基因片断FimA。以C1、C2为引物，扩增5'端带有SacⅠ酶切位点和Flag标签序列，3'端带有ApalⅠ酶切位点的1074bp的基因片段OmpC。再将FimA和OmpC与T载体进行亚克隆连接构建，获得二者基因融合的重组质粒pMD18-T-OmpC-fimA，构建了Ⅰ型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(OmpC)的融合基因片段。
　　利用限制性内切酶SacⅠ和ApaⅠ将融合基因片段酶切后定向插入含有HCE组成型强启动子并具有锚定结构序列(Anchor)的乳酸菌组成型表面表达载体pPG-T7g10-PPT中，并将重组质粒pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA电转化入工程菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei393和鸡肠道分离的乳酸杆菌M-11（Lactobacillus saerimneri）中，构建获得了两株重组菌pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/L393和pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA/M-11。Western blot检测结果表明融合基因在两株乳酸杆菌中均获得了表达，出现了约101KDa的特异性反应带。重组乳酸杆菌在鸡肠道内定殖特性分析结果表明，饲喂重组菌可以使肉仔鸡的日增重明显增加，与对照组相比差异显著;模拟肠道环境中，重组菌可耐受pH=3的酸性环境，在0.1％的胆汁酸盐环境中可良好生长;重组菌可在鸡肠道内定殖，在免疫后的14天，重组菌的数量趋于稳定，一直持续需到免疫后的第28天，重组菌的数量保持稳定，可见重组菌能够在鸡肠道内定殖。
　　综上，本研究通过鸡肠道内乳酸菌的分离鉴定，获得了8株乳酸杆菌，利用乳酸菌组成型表达载体质粒，构建了表达APEC保护性抗原FimA和OmpC串联融合表达的重组乳酸杆菌，该重组菌能够在鸡肠道内定殖，具有益生菌的特性，该菌株为防制禽致病性大肠埃希氏菌引起的大肠杆菌疾病提供理想的疫苗候选菌株。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 禽致病性大肠杆菌及其病原特性

1．1．1 禽大肠杆菌病流行及危害

1．1．2 禽致病性大肠杆菌生物学特性

1．2 禽大肠杆菌病的防治现状

1．3 乳酸杆菌做为黏膜免疫递送载体的研究进展

1．3．1 黏膜免疫的机理研究

1．3．2 乳酸杆菌递送载体的研究现状

1．4 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 实验动物

2．1．3 引物合成

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要实验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 鸡肠道乳酸菌的分离及生化反应特性鉴定

2．2．2 乳杆菌生理特性试验

2．2．3 乳杆菌体外粘附实验

2．2．4 表达OmpC-FimA融合基因的重组乳酸杆菌的构建

2．2．5 重组乳酸杆菌的表达及鉴定

2．2．6 重组乳酸杆菌在鸡肠道内的定殖特性

3 结果

3．1 鸡肠道内定殖的乳酸菌分离及生化反应特性研究

3．2 乳酸杆菌生理特性试验

3．2．1 乳酸杆菌在37℃和42℃生长特性的测定

3．2．2 抑菌实验结果

3．2．3 药物敏感性实验结果

3．3 乳酸杆菌体外粘附实验结果

3．4 表达OmpC-FimA融合基因的重组乳酸杆菌的构建结果

3．4．1 APEC的O1血清型FimA与OmpC基因的PCR扩增结果

3．4．2 重组乳酸杆菌表达载体pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA的鉴定结果

3．4．3 重组乳酸杆菌表达产物western blot鉴定

3．5 重组乳酸杆菌在鸡肠道内定殖特性分析结果

3．5．1 重组乳酸杆菌的安全性

3．5．2 重组乳酸杆菌在消化道环境中的生存性能

3．5．3 重组乳酸杆菌在鸡肠道内的定殖能力试验

4 讨论

4．1 肠道分离的乳酸杆菌的主要生物学特性

4．2 主要免疫保护性抗原基因的选择

4．3 外源基因在乳酸菌中的表达情况

4．4 外源基因电转化乳酸杆菌的影响因素

4．5 重组乳酸杆菌在肠道中生存和定殖情况

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文