黄瓜CsWRKY30基因在霜霉威胁迫中功能分析

摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.）是一种深受大众喜爱的瓜果类蔬菜之一，目前在我国主要以设施栽培为主，由于设施环境内特殊的气候条件和连年种植，在黄瓜生产中极易诱发霜霉病。霜霉威是一种可以有效防治黄瓜霜霉病的药剂，但是由于其具有挥发性和传导性，很容易在黄瓜体内蓄积或散落在空气中，不能被及时消解的农药会引发食品安全和环境污染等问题。因此，开展黄瓜果实中霜霉威残留性的相关研究具有重要研究价值，最终将为蔬菜市场提供符合大众需求的无公害黄瓜产品。
　　目前对于蔬菜农药残留问题的研究主要集中于减少农药投入和加速农药在植物体内的代谢两个方面，而本实验室前期对低农药（霜霉威）残留量黄瓜品种D0351在霜霉威胁迫下的转录组进行分析发现，转录因子Cs WRKY30可能与黄瓜霜霉威胁迫相关，该基因在霜霉威诱导下上调表达，推测该基因可能参与了霜霉威胁迫中某些信号的转导，并降低了黄瓜霜霉威残留量。因此，本实验主要利用分子生物学手段开展研究，获得以下研究结果:
　　(1)采用PCR技术扩增CsWRKY30基因的CDS序列全长为1014 bp，其编码的337个氨基酸中包含一个WRKY结构域，属于WRKY家族中的一员，并对该基因编码的氨基酸序列进行理化性质分析、蛋白质结构域及功能域预测、同源序列性比对及系统进化分析;
　　(2)利用qPCR分析CsWRKY30基因的表达模式，结果表明:黄瓜遭受霜霉威胁迫时，CsWRKY30在D0351（低霜霉威残留品种）中表达量显著上调，而在D9320（高霜霉威残留品种）中表达量并没有发生改变;在霜霉威胁迫0.5 h-9 h间，Cs WRKY30在D0351中的表达量一直明显高于对照，然而在24 h以后，其表达量不再上调。CsWRKY30在不同组织部位的表达分析表明，该基因主要在黄瓜果实中表达;
　　(3)将CsWRKY30与绿色荧光蛋白(GFP)进行融合，并转入拟南芥原生质体中，荧光显微镜下观察发现，CsWRKY30蛋白定位在细胞核上;
　　(4)构建植物过量表达载体pCAMBIA1303-CsWRKY30，将Cs WRKY30基因转入哥伦比亚野生型拟南芥。对转基因株系进行霜霉威胁迫的实验中发现，在未处理条件下，Cs WRKY30转基因拟南芥的表型与野生型并无差异;在2mM霜霉威胁迫下的CsWRKY30转基因株系萌发率及主根长均显著高于野生型;
　　(5)对CsWRKY30基因进行其他胁迫处理，发现CsWRKY30对霜霉威和多主棒孢霉菌条件积极响应，对干旱和高盐没有作用，同时受到ABA信号诱导;
　　(6)将pCAMBIA1303-CsWRKY30转化到高农药残留黄瓜品种(649)中，并获得转基因F1代黄瓜种子。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的和意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 解决蔬菜农药残留问题的重要意义

1．2．2 霜霉威残留的研究进展

1．2．3 WRK转录因子家族

1．3 研究内容及技术路线

1．3．1 试验主要内容

1．3．2 试验技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 霜霉威胁迫材料获得

2．1．2 其他逆境胁迫材料获得

2．1．3 试验所用拟南芥材料

2．2 试验试剂及菌株

2．3 CsWRKY30基因的克隆

2．3．1 黄瓜果实RNA的提取与检测

2．3．2 cDNA第1链的合成

2．3．3 CsWRKY30基因的克隆

2．3．4 CsWRKY30基因PCR扩增产物的回收

2．3．5 连接pEASY-T3载体与阳性克隆筛选

2．4 CsWRKY30基因的序列分析

2．5 CsWRKY30表达模式分析

2．6 CsWRKY30亚细胞定位分析

2．6．1 植物绿色荧光表达载体的构建

2．6．2 高浓度质粒的制备

2．6．3 拟南芥原生质体细胞的提取

2．6．4 pCAMBIA1302-CsWRKY30质粒转化拟南芥原生质体

2．7 CsWRKY30基因对拟南芥的遗传转化

2．7．1 CsWRKY30植物过量表达载体的构建

2．7．2 重组质粒导入根癌农杆菌

2．8 花序侵染法将pCAMBIA1303-CsWRKY30转入拟南芥

2．8．1 拟南芥转基因植株T0代种子获得

2．8．2 潮霉素(Hygr)抗压浓度的确定

2．8．3 拟南芥纯合株系的获得

2．8．4 转基因拟南芥的分子鉴定

2．8．5 转基因拟南芥在霜霉威胁迫下的功能分析

2．9 CsWRKY30基因对黄瓜遗传转化

2．9．1 试验材料与培养基

2．9．2 转基因实验方法

3 结果与分析

3．1 CsWRKY30基因的克隆

3．1．1 植物总RNA的提取

3．1．2 CsWRKY30基因全长及酶切验证

3．2 CsWRKY30序列分析

3．2．1 CsWRKY30基因序列分析

3．2．2 系统发生树分析

3．2．3 启动子顺式元件分析

3．3 CsWRKY30基因表达模式分析

3．3．1 CsWRKY30在霜霉威残留量不同的黄瓜品种中的表达分析

3．3．2 CsWRKY30基因时空表达特性分析

3．3．3 CsWRKY30组织特异性表达分析

3．4 CsWRKY30亚细胞定位分析

3．4．1 pCAMBIA1302-CsWRKY30融合表达载体的鉴定

3．4．2 拟南芥原生质体中的定位与分析

3．5 CsWRKY30基因在霜霉威胁迫下的功能分析

3．5．1 植物过量表达载体pCAMBIA1303-CsWRKY30的构建

3．5．2 35S-CsWRKY30植物过量表达载体转入根癌农杆菌

3．5．3 潮霉素筛选抗压的确定

3．5．4 转基因拟南芥抗性植株的筛选

3．5．5 转基因植株的PCR检测

3．5．6 转基因拟南芥纯合株系的荧光PCR鉴定

3．5．7 转CsWRKY30基因拟南芥在霜霉威胁迫下功能分析

3．6 CsWRKY30受脱落酸诱导表达分析

3．7 其他逆境胁迫CsWRKY30表达分析

3．8 黄瓜遗传转化

3．8．1 CsWRKY30转基因黄瓜的获得

3．8．2 抗性黄瓜植株的分子鉴定

4 讨论

4．1 CsWRKY30启动子中的顺式元件

4．2 CsWRKY30基因具有独特的响应模式

4．3 CsWRKY30是核主效蛋白

4．4 CsWRKY30的过表达可以提高拟南芥对霜霉威的耐受性

4．5 CsWRKY30受ABA信号诱导

4．6 CsWRKY30基因参与生物胁迫

4．7 展望

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文