拟南芥脂肪族芥子油苷侧链修饰酶基因的鉴定与分析

摘要

芥子油苷是一种由氨基酸衍生而来的次级代谢产物，富含氮和硫等元素，在模式植物拟南芥和一些重要的蔬菜经济作物如白菜、西兰花等十字花科植物中广泛存在。芥子油苷主要分为吲哚族芥子油苷、脂肪族芥子油苷和芳香族芥子油苷。黑芥子酶是芥子油苷的水解酶，在植物体内与芥子油苷互相隔离、同时存在，当植物叶片遭受外界损伤时黑芥子酶与芥子油苷产生接触，并将芥子油苷水解为一系列化学物质。芥子油苷及其水解产物具有多种生物活性，可以帮助植物防御病原菌的侵染、抵御食草动物和昆虫的取食、参与调控植物生长素的合成，对人类也具有很好的抗肿瘤活性。其中，8-甲基亚磺酰辛基芥子油苷水解产生的异硫氰酸盐对核盘菌有很强的毒性，4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷的水解产物萝卜硫素是目前已知的植物中最强的抗癌成分。因此，对芥子油苷生物合成的研究具有重要的理论意义和应用价值。
　　脂肪族芥子油苷水解产物的生物活性与其侧链的长度和结构密切相关。黄素单氧化酶FMOGS-OX是脂肪族芥子油苷生物合成的侧链修饰酶，催化侧链的次级修饰，将甲基硫烷基芥子油苷(MT GSL)中的硫氧化生成甲基亚磺酰烷基芥子油苷(MS GSL)。目前，在FMOGSOX基因家族中已鉴定出5个侧链修饰酶基因，为FMOGSOX1、FMOGS-OX2、FMOGS-OX3、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5。根据生物信息学分析，t1g12130、At1g12160和At1g12200与上述5个基因亲缘关系较近，且均被预测具有硫氧化活性，且可能参与脂肪族芥子油苷的侧链氧化过程。因此将这三个基因作为FMOGS-OX家族的候选基因。在本论文中，为了描述方便，暂将At1g12130命名为FMOGS-OX6,将At1g12160命名为FMOGS-OX7,将At1g12200命名为FMOGS-OX8。
　　为了验证这三个基因的功能，拟构建该三个基因的过表达突变体，并通过商业途径购买获得基因功能缺失突变体，并进行组织定位研究。本实验室已有部分前期工作基础，FMOGS-OX6、FMOGS-OX基因的组织定位和FMOGS-OX8的突变体构建已经完成。本论文在此基础上继续完成对三个基因的功能鉴定研究，主要研究结果如下:
　　(1)获得了FMOGS-OX6、FMOGS-OX7基因的过表达株系
　　以pCAMBIA230035Su为基础，导入FMOGS-OX6、FMOGS-OX7的克隆片段，得到35∷ MOGS-OX6、35S∷FMOGS-OX7植物过表达载体，进一步通过农杆菌介导拟南芥遗传转化和分子检测获得FMOGS-OX6和FMOGS-OX7的过量表达株系。
　　(2)鉴定出2个新的拟南芥脂肪族芥子油苷侧链修饰酶
　　芥子油苷检测结果显示，与野生型相比，FMOGS-OX6的过表达株系的种子中，MT:(MT+MS)有显著降低，在叶片中无明显变化;FMOGS-OX7的过表达株系的叶片和种子中MT:(MT+MS)都有显著的降低;在FMOGS-OX6与FMOGS-OX7的缺失突变体中芥子油苷表型无明显变化，推测可能是由于其它FMOGS-OX基因产生的冗余功能。上述结果表明，FMOGS-OX6、 FMOGS-OX7能够催化MT GSL，具有脂肪族芥子油苷侧链修饰酶的功能。
　　FMOGS-OX8功能表现不明显，不具备对MT GSL的催化功能。
　　(3)明确了FMOGS-OX8的表达模式
　　FMOGS-OX8基因在萌发期、成熟期表达水平较高，在新生幼叶中表达水平较高，在主叶脉、侧根与主根交叉点、叶柄与下胚轴交叉点表达量较高。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 芥子油苷概述

1．2 芥子油苷代谢研究进展

1．2．1 芥子油苷生物合成研究进展

1．2．2 芥子油苷生物降解研究进展

1．3 芥子油苷及其降解产物的生物学功能

1．3．1 防御作用

1．3．2 抗癌活性

1．3．3 参与调控生长素IAA的合成

1．4 黄素单氧化酶FMO研究进展

1．4．1 黄素单氧化酶FMO概述

1．4．2 拟南芥中黄素单氧化酶FMO研究进展

1．4．3 拟南芥中FMOGS-OX基因研究进展

1．5 研究的目的与意义

1．6 研究内容与技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 生化试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基因的生物信息学分析

2．2．2 FMOGS-OX6与FMOGS-OX7基因克隆

2．2．3 35S：：FMOGS-OX6和35S：：FMOGS-OX7植物表达载体的构建

2．2．4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

2．2．5 转基因植株的分子生物学检测

2．2．6 芥子油苷的提取和检测

2．2．7 FMOGS-OX8基因的组织定位

3 结果与分析

3．1 FMOGS-OX6和FMOGS-OX7基因的生物信息学分析

3．2 FMOGS-OX6和FMOGS-OX7基因的克隆

3．3 35S：：FMOGS-OX6和35S：：FMOGS-OX7植物表达载体的构建

3．4 35S：：FMOGS-OX6和35S：：FMOGS-OX7转基因拟南芥的构建

3．5 转基因植株的分子生物学检测

3．5．1 转基因植株中外源基因表达情况的PCR检测

3．5．2 转基因植株中外源基因表达水平的RT-PCR检测

3．6 转基因植株芥子油苷的检测

3．6．1 芥子油苷提取材料的鉴定

3．6．2 35S：：FMOGS-OX6转基因植株芥子油苷含量分析

3．6．3 35S：：FMOGS-OX7转基因植株芥子油苷含量分析

3．6．4 35S：：FMOGS-OX8转基因植株芥子油苷含量分析

3．7 FMOGS-OX8基因的组织定位分析

4 讨论

4．1 FMOGS-OX6功能的探讨

4．2 FMOGS-OX7功能的探讨

4．3 FMOGS-OX8功能的探讨

4．4 芥子油苷侧链修饰与其生物活性的关系

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文