连作土壤寄生真菌多样性及对大豆胞囊线虫抑制作用

摘要

大豆胞囊线虫（Heterodera glycines，Ichinohe）病是大豆生产中的重要限制因子之一，其病原大豆胞囊线虫是一种典型定居型内寄生土传线虫，大豆连作会使土壤中大豆胞囊线虫不断积累，导致病害加重，因此大豆胞囊线虫也是引起大豆连作障碍的主要因素之一。然而，当大豆感病品种连续种植5年以上，会出现大豆胞囊线虫自然衰退现象，并将存在这种现象的土壤称为大豆胞囊线虫抑制性土壤。抑制性土壤中寄生微生物-大豆胞囊线虫-大豆三者之间形成一种特殊的环境抑制生态系统。大豆胞囊线虫寄生真菌作为抑制性土壤中的抑制因子之一，在该抑制生态系统中作用至关重要。为了探讨抑制性土壤中大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌多样性及其作用，以大豆长期定位轮作体系为研究对象，采用大豆胞囊线虫寄生真菌传统分离方法，利用形态学和分子生物学鉴定，并结合Biolog微平板分析技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法，研究大豆长期连作（23年）、大豆2年连作（玉米-大豆-大豆，8个循环周期）和长期轮作（小麦-玉米-大豆，8个轮作周期）下大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群特征、优势寄生真菌种类多样性及对大豆胞囊线虫致病作用。通过解析大豆胞囊线虫抑制性土壤中大豆胞囊线虫寄生真菌种群结构特征和明确大豆胞囊线虫优势寄生真菌作用，进一步揭示了大豆胞囊线虫抑制性土壤衰退机制，对抑制性土壤抑制生态系统和线虫生态研究具有重要的价值和意义。
　　通过对大豆长期定位轮作体系下大豆胞囊线虫种群密度和大豆生长情况调查，结果显示，大豆经过23年连作以后，大豆胞囊线虫种群密度下降，盛花期和鼓粒盛期表现尤为明显。在大豆盛花期和鼓粒盛期土壤中饱满胞囊密度每100g土中均仅含有7个，显著低于大豆2年连作(P＜0.05)，与轮作差异不显著。大豆23年连作下，土壤中大豆胞囊线虫空胞囊占总胞囊数量比率显著升高，在大豆盛花期和鼓粒盛期，空胞囊比率可达到70％，显著高于大豆2年连作。在大豆整个生育期进程中，大豆胞囊线虫种群密度变化特征存在差异。大豆2年连作和轮作下，在大豆生育期进程中大豆胞囊线虫种群密度呈现增加趋势，而大豆23年连作下，大豆胞囊线虫种群密度变化不明显，且在大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫种群密度有下降趋势。此外，大豆23年连作下，由于大豆胞囊线虫种群密度下降，大豆生长状况明显改善，大豆产量较大豆2年连作明显升高。说明大豆经过长期连作以后形成抑制性土壤，控制大豆胞囊线虫种群密度，改善由于连作障碍引起的大豆生长不良和产量降低现象，且在盛花期和鼓粒盛期对大豆胞囊线虫种群密度抑制作用尤为明显。
　　采用Biolog微平板方法对大豆23年连作、大豆2年连作和轮作方式下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物功能多样性进行研究，结果显示，在大豆整个生育期进程中，大豆2年连作下，大豆胞囊线虫寄生微生物碳源利用能力有增加趋势，且对碳源的利用程度较为均匀。大豆23年连作除播前期外，在大豆整个生育期进程中与轮作结果相似，微生物活性和功能多样性均没有明显变化，但是大豆23年连作下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物对碳源的利用程度差异较大。冗余分析结果表明，3种轮作方式下，大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物主要利用的碳源类型存在差异。主成分分析结果发现，在大豆整个生育期进程中，大豆23年连作、轮作和大豆2年连作下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物对碳源的利用能力明显分成3组，而主要引起这种差异的碳源类型为糖类、氨基酸类、羧酸类和多聚物类。说明大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物功能多样性与大豆胞囊线虫种群密度呈正相关，且大豆经过23年连作以后大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物种群发生改变，有优势微生物存在。
　　通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对不同轮作体系下大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群多样性进行分析，结果表明，在大豆整个生育期进程中，大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构存在变化，不同轮作体系之间条带亮度和数量存在差异，大豆23年连作下存在特异性条带，在大豆整个生育期进程中，大豆23年连作和轮作下随着大豆生育期的推进，大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群多样性存在增加趋势，且胞囊寄生真菌多样性明显高于大豆2年连作。对DGGE图谱中具有代表性20条特异性条带进行DNA序列切胶测序，结果表明，这些大豆胞囊线虫寄生真菌种群主要分布于子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。主成分分析结果表明，在大豆生育期进程中3种轮作方式下，大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群明显分开，大豆经过长期连作以后，大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构发生明显改变。大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌Aeremonium sclerotigenum、Paraphomaradicina、Mortierella elongata、Verticillium chlamydosporium和口Galactomyces candidum为大豆23年连作下优势大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌，大豆2年连作下优势大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌包括:Paraphoma chrysanthemicola、Cylindrocarpon sp.、Neonectria ramulariae、Fusarium oxysporum和Galactomyces candidum。说明大豆经过长期连作以后，土壤中大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构发生明显改变，并形成特有的大豆胞囊线虫优势胞囊寄生真菌。
　　采用传统形态学和分子生物学相结合的方法鉴定不同轮作体系下大豆胞囊线虫优势和特殊寄生真菌。结果表明，不同轮作体系下大豆胞囊线虫寄生真菌主要包括:尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、厚垣轮枝菌（Verticillium chlamydosporium）、互隔交链孢霉（Alternaria alternate）、根异茎点霉（Paraphoma radicina）、Neonectria radicicola、链蠕孢属（Dendryphion nanum）、轮状镰孢菌（Fusarium verticillioides）、短梗蠕孢菌（Trichocladium opacum）、长被孢霉（Mortierella elongata）、淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）、青霉（Penicillium polonicum）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、花斑曲霉（Aspergillus versicolor）和黑曲霉(Aspergillus niger)。这些大豆胞囊线虫寄生真菌很可能是对大豆胞囊线虫具有潜力的生防真菌。
　　利用传统大豆胞囊线虫寄生真菌分离方法，对不同轮作体系下大豆胞囊线虫优势寄生真菌分离，结果表明在大豆23年连作下，大豆整个生育期内，从大豆胞囊线虫不同虫态上均分离到了大豆胞囊线虫优势寄生真菌镰孢菌（Fusarium spp.）、厚垣轮枝菌（Verticilliumchlamydosporium）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus），且数量明显高于大豆2年连作和轮作。其中23年连作下，大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率为1.3％和2.6％，而大豆2年连作下盛花期未分离到大豆胞囊线虫卵寄生真菌，鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率仅为0.1％。轮作盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率也仅为0.4％和0.8％。大豆23年连作下，在大豆盛花期和鼓粒盛期优势寄生真菌分离数量出现明显升高趋势。同时，大豆胞囊线虫优势寄生真菌与大豆胞囊线虫种群密度呈现一定负相关趋势，说明大豆胞囊线虫寄生真菌很可能与抑制性土壤中大豆胞囊线虫种群密度自然衰退有关。
　　对抑制性土壤中大豆胞囊线虫优势寄生真菌镰孢菌（Fusarium spp.）、厚垣轮枝菌（Verticillium chlamydosporium）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）不同菌株寄生不同虫态大豆胞囊线虫致病性测定研究结果显示，不同种寄生真菌和同种寄生真菌不同菌株之间对大豆胞囊线虫的抑制效果均存在差异。其中镰孢菌H-4-E-14、G-4-E-16和4-G-C-A菌株对大豆胞囊线虫抑制作用均达到90％以上，H-4-E-14菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化的抑制率最高可达97.1％，菌株G-4-E-16对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率较高为90.6％，4-G-C-A菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用最佳，可达到95.3％。厚垣轮枝菌菌株4-H-C-12对大豆胞囊线虫胞囊孵化抑制作用最好达到95.2％，而菌株4-G-C-6对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率最高为81.6％，4-H-C-12菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用也较好达到96％。淡紫拟青霉17-H-C-15菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化的抑制率最好达到96.8％，而菌株4-G-C-10对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制效果最好，该菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用也较强可达到92％。说明这些大豆胞囊线虫寄生真菌均可通过寄生作用抑制大豆胞囊线虫胞囊和卵孵化及J2活性。
　　综上所述，大豆经长期连作形成大豆胞囊线虫抑制性土壤，控制了大豆胞囊线虫病发生，改善了大豆生长状况，在一定程度上可提高大豆产量，改变了大豆胞囊线虫寄生真菌种群结构，在大豆长期连作进程中积累大豆胞囊线虫寄生真菌，形成优势寄生真菌种类，从而控制大豆胞囊线虫种群密度。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大豆胞囊线虫的危害

1．1．1 大豆胞囊线虫病的危害与分布

1．1．2 大豆胞囊线虫病病原

1．1．3 大豆胞囊线虫病防治措施

1．2 环境因素对大豆胞囊线虫病发生程度的影响

1．2．1 土壤环境对大豆胞囊线虫病发生程度的影响

1．2．2 土壤类型对大豆胞囊线虫病发生程度的影响

1．2．3 农业管理措施对大豆胞囊线虫病发生程度的影响

1．3 不同轮作体系对大豆胞囊线虫病的影响

1．3．1 大豆轮作对大豆胞囊线虫病的抑制作用

1．3．2 大豆连作对大豆胞囊线虫病的影响

1．4 大豆胞囊线虫抑制性土壤研究

1．4．1 大豆胞囊线虫自然衰退现象发生与抑制性土壤形成

1．4．2 寄生真菌在抑制性土壤中的作用

1．5 微生物种群多样性研究方法

1．5．1 微生物平板计数法

1．5．2 变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术

1．5．3 Biolog碳素利用法

1．5．4 磷脂脂肪酸(PLFA)法

1．5．5 高通量测序技术

1．6 存在问题

1．7 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 土壤样品采集地点

2．2 土壤样品采集轮作体系

2．3 取样时间

2．4 试验材料

2．4．1 供试培养基

2．4．2 主要供试仪器设备

2．4．3 主要试剂

2．5 试验方法

2．5．1 土壤样品采集

2．5．2 土壤中大豆胞囊线虫胞囊分离

2．5．3 土壤中大豆胞囊线虫卵分离

2．5．4 土壤中大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)分离

2．5．5 大豆根表大豆胞囊线虫雌虫计数

2．5．6 大豆根表大豆胞囊线虫雌虫内卵和J2分离

2．5．7 大豆生长指标测定

2．5．8 田间大豆产量测定

2．5．9 大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物悬浮液置备

2．5．10 大豆胞囊线虫寄生微生物Biolog分析

2．5．11 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌DNA提取

2．5．12 胞囊寄生真菌DNA PCR扩增

2．5．13 胞囊寄生真菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测

2．5．14 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌分离

2．5．15 大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离

2．5．16 大豆胞囊线虫J2寄生真菌分离

2．5．17 大豆胞囊线虫寄生真菌形态学鉴定

2．5．18 大豆胞囊线虫寄生真菌分子生物学鉴定

2．5．19 大豆胞囊线虫卵悬液制备

2．5．20 大豆胞囊线虫J2悬液制备

2．5．21 大豆胞囊线虫寄生真菌致病性测定

2．6 数据统计

3 结果与分析

3．1 大豆长期连作大豆胞囊线虫种群密度特征

3．1．1 不同轮作体系对土壤中大豆胞囊线虫饱满胞囊密度的影响

3．1．2 不同轮作体系对土壤中空胞囊比率的影响

3．1．3 不同轮作体系对土壤中大豆胞囊线虫卵密度的影响

3．1．4 不同轮作体系对土壤中大豆胞囊线虫单胞囊卵量的影响

3．1．5 不同轮作体系对土壤中大豆胞囊线虫J2密度的影响

3．1．6 不同轮作体系对大豆根表大豆胞囊线虫雌虫密度的影响

3．1．7 不同轮作体系对大豆胞囊线虫根表雌虫内卵密度的影响

3．1．8 不同轮作体系对大豆胞囊线虫根内J2密度的影响

3．1．9 不同轮作体系对大豆生长发育的影响

3．1．10 不同轮作体系对大豆产量的影响

3．2 大豆长期连作胞囊寄生微生物功能多样性特征

3．2．1 不同轮作体系对胞囊寄生微生物平均颜色变化率的影响

3．2．2 不同轮作体系对大豆胞囊线虫寄生微生物多样性指数的影响

3．2．3 不同轮作体系下胞囊寄生微生物冗余分析

3．2．4 不同轮作体系下大豆胞囊寄生微生物碳代谢功能主成分分析

3．3 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构多样性特征

3．3．1 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌DGGE图谱分析

3．3．2 胞囊寄生真菌DGGE条带数、多样性指数和均匀度指数分析

3．3．3 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌DGGE图谱特征条带系统发育分析

3．3．4 大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌DGGE图谱主成分分析

3．4 大豆胞囊线虫寄生真菌鉴定

3．4．1 大豆胞囊线虫寄生真菌形态学鉴定

3．4．2 大豆胞囊线虫寄生真菌分子生物学鉴定

3．5 大豆长期连作大豆胞囊线虫寄生真菌分布特征

3．5．1 不同轮作体系对大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌的影响

3．5．2 不同轮作体系对大豆胞囊线虫卵寄生真菌的影响

3．5．3 不同轮作体系对大豆胞囊线虫J2寄生真菌的影响

3．5．4 大豆胞囊线虫优势寄生真菌与大豆胞囊线虫密度相关性分析

3．6 大豆胞囊线虫寄生真菌对大豆胞囊线虫的抑制作用

3．6．1 大豆胞囊线虫寄生真菌对大豆胞囊线虫胞囊孵化的抑制作用

3．6．2 大豆胞囊线虫寄生真菌对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制作用

3．6．3 大豆胞囊线虫寄生真菌对大豆胞囊线虫J2的致死作用

4 讨论

4．1 大豆长期连作影响大豆胞囊线虫种群密度特征

4．2 大豆长期连作影响胞囊寄生微生物功能多样性特征

4．3 大豆长期连作影响胞囊寄生真菌种群结构特征

4．4 大豆长期连作形成大豆胞囊线虫优势寄生真菌

4．5 大豆长期连作影响大豆胞囊线虫优势寄生真菌分布特征

4．6 大豆胞囊线虫寄生真菌对大豆胞囊线虫存在抑制作用

5 结论

5．1 大豆长期连作抑制大豆胞囊线虫种群密度改善大豆生长情况

5．2 大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物功能多样性与线虫种群密度有关

5．3 大豆长期连作影响大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构多样性

5．4 大豆胞囊线虫优势和特殊寄生真菌主要包括11属和14个种

5．5 大豆长期连作积累优势大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌

5．6 大豆长期连作下胞囊线虫寄生真菌为抑制性土壤主要抑制因子

5．7 创新点

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文