鸡毒支原体脂质相关膜蛋白和GroEL蛋白诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究

摘要

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，M.gallisepticum）属于支原体属，能够引起鸡慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease，CRD）、气囊炎和气管炎。鸡毒支原体能够黏附到宿主表面，激活宿主体内相关信号通路，造成宿主细胞损伤或凋亡。鸡毒支原体无细胞膜，但其表面存在着大量脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)。许多研究表明，LAMPs可以黏附到宿主细胞表面，激活宿主的天然免疫应答，但是LAMPs如何激活宿主天然免疫应答的具体机制尚未报道。
　　病原微生物入侵到动物体内时，动物体首先启动天然免疫反应，产生天然免疫应答，进而释放相关炎症因子起到抗感染的作用。在天然免疫应答的研究中，NF-κB信号通路研究的最为广泛，存在于动物细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)在此过程中起到识别作用。TLRs家族成员众多，各自能够特异性识别配体，如TLR2和TLR4可以识别革兰氏阳性菌表面的脂蛋白，激活下游信号分子，启动数种信号通路并释放相应的细胞因子，造成宿主细胞的损伤或凋亡。由于支原体LAMPs在结构上与革兰氏阳性菌表面的脂蛋白相似，所以本实验旨在研究感染鸡毒支原体后是否能够激活NF-κB信号通路并引起IL-1β的释放，并且验证TLR2和MyD88在此过程中的作用。
　　鸡毒支原体LAMPs为混合物，其中含有的许多膜蛋白具有较高免疫原性，但其中何种蛋白能够激活鸡的天然免疫应答目前尚未明确。在大肠杆菌的相关研究中证实，GroEL有较好的免疫原性。因此，研究鸡毒支原体GroEL是否具有同样的高免疫活性，是否可以激活鸡的天然免疫应答对鸡毒支原体致病机制的研究具有重要意义。
　　为研究鸡毒支原体LAMPs和GroEL诱导DF-1细胞IL-1β释放的机制，本研究以鸡成纤维细胞(DF-1)为细胞模型，首先利用SYBR GreenⅠ Real-time PCR和ELISA方法检测LAMPs及GroEL蛋白刺激后的DF-1细胞中IL-1β的释放量。结果表明:鸡毒支原体的LAMPs及GroEL均能有效诱导DF-1细胞释放IL-1β，且IL-1β的释放量呈时间和剂量梯度。为了检测NF-κB信号通路是否被激活，本研究采用激光共聚焦检测p65入核和Western blot技术检测p65磷酸化水平。结果显示:鸡毒支原体LAMPs能够有效诱导DF-1细胞p65进核，并且鸡毒支原体LAMPs和GroEL均能使p65磷酸化水平提高，从而确定鸡毒支原体LAMPs和GroEL均能够激活NF-κB信号通路。为明确MyD88和TLR2在此过程中的作用，采用质粒转染，抗体封闭方法使MyD88和TLR2过表达或沉默，检测两种情况下IL-1β表达情况。经检测显示:过表达MyD88、TLR2组的IL-1β mRNA和蛋白水平显著升高，而抗体封闭TLR2组和MyD88沉默组的IL-1β mRNA和蛋白水平下降。证实LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合，并激活下游接头分子MyD88，从而有效诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β。GroEL蛋白在大肠杆菌中具有较高的免疫原性，为了证明其在鸡毒支原体激活宿主天然免疫应答中的作用，本研究采用激光共聚焦检测其黏附作用。结果表明:GroEL蛋白可以成功的黏附到DF-1细胞表面，这为GroEL蛋白发挥作用提供了基础。为了确定鸡毒支原体GroEL激活宿主天然免疫的机制，本研究采用蛋白互作技术手段，即GST pulldown和免疫共沉淀，明确其在DF-1细胞中的互作蛋白。结果显示:GroEL蛋白能够与DF-1细胞中的Annexin A2蛋白相互作用，为后期GroEL致病机制的研究提供了重要的实验依据，也为鸡毒支原体的致病机制提供了理论基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 鸡毒支原体概述

1．2 鸡毒支原体的研究进展

1．2．1 鸡毒支原体流行病学

1．2．2 鸡毒支原体病的症状

1．2．3 鸡毒支原体的诊断

1．3 鸡毒支原体的致病机理

1．3．1 直接致病作用

1．3．2 免疫损伤机制

1．4 鸡毒支原体的防治

1．4．1 消灭种卵内鸡毒支原体

1．4．2 疫苗中鸡毒支原体的检测

1．4．3 疫苗免疫接种

1．5 鸡毒支原体GroEL的结构与功能

1．5．1 热休克蛋白的概述

1．5．2 GroEL的结构

1．5．3 GroEL的作用机制

1．6 蛋白互作的研究方法

1．6．1 分子生物学方法

1．6．2 分子物理学方法

1．6．3 生物信息学研究方法

1．7 目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞、菌株及质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要设备

2．2 方法

2．2．1 主要试剂的配制

2．2．2 引物的设计与合成

2．2．3 目的基因的扩增

2．2．4 重组质粒构建与鉴定

2．2．5 鸡毒支原体培养方法及LAMPs提取

2．2．7 IL-1β的最佳诱导时间和最佳诱导剂量的确定

2．2．8 激光共聚焦显微镜检测p65转核

2．2．9 Western blot检测p65磷酸化

2．2．13 GST-GroEL的黏附特性

2．2．15 免疫共沉淀

3 结果与分析

3．1 目的基因的扩增

3．2 重组质粒构建

3．3 LAMPs诱导DF-1细胞IL-1β表达的最佳剂量

3．5 亚细胞定位LAMPs诱导DF-1细胞p65转核

3．6 Western Blot检测LAMPs诱导DF-1细胞p65磷酸化

3．8 MyD88对LAMPs刺激的DF-1细胞IL-1β表达水平的影响

3．9 GST-GroEL蛋白的表达及纯化

3．10 GST-GroEL蛋白的黏附特性

3．11 GST-GroEL诱导DF-1细胞IL-1β表达

3．13 GST pulldown钓取DF-1细胞蛋白

3．14 免疫共沉淀验证GroEL蛋白与Annexin2相互作用

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文