哈尔滨市鸡缺硒性疾病流行病学调查及硒蛋白K生物学功能的初步研究

摘要

硒(Se)作为一种必需的微量元素，对于维持人和动物机体正常生命活动起着非常重要的作用。硒缺乏可导致鸡的脑、心脏、肝脏、胰腺及肌肉等组织、器官的损伤甚至死亡，因此硒缺乏性疾病成为了危害养禽业的主要营养代谢性疾病之一。原发的硒缺乏性疾病具有明显的地域性，因此地区性的鸡缺硒性疾病的流行病学调查将为合理防治该病提供有力的参考。硒在生物体内主要是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生物学功能，其中硒蛋白K(Selk)是近几年才被揭示的一种定居在内质网上的小分子硒蛋白。研究证明哺乳类动物Selk的缺失可以引起T淋巴细胞的增殖、迁移受阻，巨噬细胞功能障碍，细胞因子分泌紊乱，机体免疫功能失衡，抗病毒能力下降。在禽类，初步研究发现，Selk具有抗氧化和钙稳态调控的功能并且参与缺硒性骨骼肌损伤，但是Selk在鸡体内的具体生物功能还未揭示。
　　哈尔滨市地处硒缺乏区域，是鸡硒缺乏性疾病的高发区，为了明确哈尔滨市该病的发病情况及阐明硒蛋白K的生物学功能。本研究对该地区鸡缺硒性疾病进行了流行病学调查;复制了鸡硒缺乏症模型，检测了骨骼肌中炎症、内质网应激及凋亡等相关指标;建立了Selk敲低鸡胚成肌细胞模型，检测氧化应激、硒蛋白、炎症因子、热休克蛋白、钙稳态、糖代谢及肌肉发育等相关指标;通过生物信息学预测了靶向Selk的microRNA(miRNA)以及靶向硬脂酰辅酶A去饱和酶(S CD)的long non coding RNA（lncRNA），利用双荧光素酶报告基因检测miRNA与Selk的靶向关系;建立了lncRNA敲低鸡胚成肌细胞模型，检测lncRNA与SCD的靶向关系及炎症等相关指标;建立了gga-let-7f-3p过表达和敲低的鸡胚成肌细胞模型及N-乙酰半胱氨酸(NAC)与过氧化氢(H2O2)的处理模型，检测了氧化应激、内质网应激与凋亡等相关指标;建立了gga-let-7f-3p过表达和敲低鸡胚成肌细胞模型，经禽流感病毒(H5N1)进行处理后，检测其中的病毒复制能力及自噬相关指标。
　　试验结果如下:
　　(1)流行病学调查结果显示，2014年至2016年间，哈尔滨市鸡缺硒性疾病，从9月份开始，占接诊病例的百分率陡增（2014年为0.77％，2015年为0.71％，2016年为0.52％）;12月份该百分率达到高峰（2014年为3.39％，2015年为3.24％，2016年为2.47％）后开始下降，1月份该百分率降为1.01％（2014年）、1.68％(2015年)与2.04％（2016年）。这提示入冬之后该病的发病率显著上升，说明该病具有明显的季节性，特定的气候因素（特别是低气温）对该病的发生及发展有重要的影响。另外，该病在肉鸡中的发病率显著高于蛋鸡，进一步研究发现4周龄的肉鸡与产蛋期蛋鸡发病率最高。这提示哈尔滨地区进入9月份后要加强饲料中维生素E及硒含量的监测，做到及时发现缺乏，从而及时准确进行补充。
　　(2)Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中25种硒蛋白的表达，Selk敲低24h后，Txnrd1、Txnrd3、Seln、Sels、Selt、Selm、Sep15、Seli、Selo与Sepx1 mRNA的表达量显著上升，而Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio3、Selw、Selh与Sepp1 mRNA的表达量显著下降;Selk敲低48h后，Gpx2与SPS2 mRNA的表达量显著上升，而Gpx1、Gpx2、Gpx4、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Dio3、Seln、Sels、Selw、Selt、Selh、Selm、Sep15、Seli、Selu、Sepp1、Selo与Sepx1 mRNA的表达量显著下降;Selk敲低72h后，Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3、Seln、Selt、Selm、Seli、Selo、Sepx1与SPS2 mRNA的表达量显著上升，而Gpx3、Dio2、Dio3与Selh mRNA的表达量显著下降。结果表明Selk具有调节其他硒蛋白表达的功能。
　　(3)硒缺乏可导致骨骼肌出现炎症及出血等典型的病理学变化，并且显著下调了骨骼肌中Selk、ALDBGALG0000005049、SCD、PPARα、PPARβ及PPARγ的表达，上调了IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-17及CCL4的表达;Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中iNOS、NF-κB、HO-1、COX-2、PTGEs、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-17及IFN-γ的表达，并且下调了ALDBGALG0000005049及SCD的表达;ALDBGALG0000005049靶向调控SCD表达，敲低ALDBGALG0000005049显著下调了鸡胚成肌细胞中SCD、PPARα、PPARβ及PPARγ的表达，上调了IL-1β、IL-6、IL-8及CCL4的表达。结果表明Selk通过调控ALDBGALG000000504-SCD通路诱导鸡骨骼肌炎症参与硒缺乏性骨骼肌损伤。
　　(4)硒缺乏显著上调了骨骼肌中ATF4、ATF6、XBP1、CHOP与Bax的表达，下调了Bcl2的表达;gga-let-7f-3p靶向调控Selk表达;过表达gga-let-7f-3p增加了鸡胚成肌细胞中SOD和CAT的活性以及ROS和MDA的水平，上调了ATF4、ATF6、XBP1、CHOP与Bax的表达，下调了Bcl2的表达，诱发细胞凋亡，这种影响可以被NAC所阻遏。敲低gga-let-7f-3p可阻遏H2O2诱导成肌细胞凋亡。结果表明gga-let-7f-3p可靶向Selk诱导鸡骨骼肌凋亡参与硒缺乏性骨骼肌损伤。
　　(5) H5N1可感染鸡胚成肌细胞，并诱发鸡胚成肌细胞自噬的产生。gga-let-7a-3p靶向调控Selk表达;敲低gga-let-7a-3p上调鸡胚成肌细胞BECN1表达，下调了HA、M1、M2、mTOR、LC3-1及P62的表达。结果表明敲低gga-let-7a-3p可通过上调Selk，抑制M2的表达，解除了M2对自噬溶酶体形成的阻碍，从而抑制H5N1在鸡胚成肌细胞中的复制。
　　(6) Selk敲低24h与72h，鸡胚成肌细胞中ITPR1、ITPR2、ITPR3、RyR1、RyR3、NCX、PMCA1、CACNA1S、TRPC1、TRPC3、STIM1、ORAl1、CaLM、CaSR、MSTN与P21的mRNA表达量显著上升;SERCA1s与CRT的mRNA表达量在Selk敲低24h显著上升，而在72h显著下降;MyoD与Myf-5的mRNA表达量在Selk敲低24h后显著下降，而在72h显著上升;Selk敲低72h，IRS1、IRS2、IGF1、GLUT1、GLUT3、GLUT8、MRF4与Myogenin的mRNA表达量显著下降。相关性分析与主成分分析表明IRS1、IRS2、IGF1、GLUT1、GLUT3与GLUT8显著影响MRF4及Myogenin，ITPR3、RyR1、PMCA1、CACNA1S、STIM1、CaLM与CRT显著影响Myogenin。因此Selk敲低显著影响了鸡胚成肌细胞中的糖代谢与钙稳态，从而影响鸡胚成肌细胞的增殖与分化，尤其影响了鸡胚成肌细胞的分化阶段。结果表明Selk具有维持鸡胚成肌细胞正常发育的功能。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 硒的生物学功能与相关疾病

1．1．1 硒的生物学功能

1．1．2 缺硒性疾病概述

1．2 畜禽缺硒性疾病的流行病学调查

1．3 硒蛋白

1．3．1 硒蛋白的分类和分布

1．3．2 硒蛋白的功能

1．4 硒蛋白K

1．4．1 硒蛋白K的结构和分布

1．4．2 硒蛋白K的功能

1．5 microRNA与LncRNA的研究进展

1．5．1 microRNA生物学功能及与疾病的关系

1．5．2 gga-let-7家族研究进展

1．5．3 LncRNA的生物学功能与相关疾病的关系

1．6 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 主要仪器与试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 哈尔滨市鸡缺硒性疾病流行病学调查

2．2．2 动物模型的建立及相关指标的检测

2．2．3 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型的建立及相关指标检测

2．2．4 鸡胚成肌细胞ALDBGALG0000005049敲低模型的建立及相关指标检测

2．2．5 鸡胚成肌细胞gga-let-7f-3p敲低和过表达模型的建立及相关指标检测

2．2．6 鸡胚成肌细胞gga-let-7a-3p敲低和过表达模型的建立及相关指标检测

2．2．7 试验数据的统计与分析

3 结果与分析

3．1 哈尔滨市鸡缺硒性疾病流行病学调查结果

3．2 鸡骨骼肌组织中相关指标检测结果

3．2．1 鸡骨骼肌组织病理显微结构观察结果

3．2．2 鸡骨骼肌组织Selk及炎症指标检测结果

3．2．3 鸡骨骼肌组织内质网应激指标检测结果

3．2．4 鸡骨骼肌组织凋亡指标检测结果

3．2．6 鸡骨骼肌组织中ALDBGALG0000005049表达的检测及靶基因的预测结果

3．3 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型的建立及相关指标检测结果

3．3．1 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中氧化损伤指标检测结果

3．3．2 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中25种硒蛋白表达的检测结果

3．3．3 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中炎症相关指标及热休克蛋白表达的检测结果

3．3．4 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中糖代谢及肌肉发育相关指标的检测结果如图

3．3．5 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中钙通道相关指标的检测结果

3．3．6 鸡胚成肌细胞Selk敲低模型中ALDBGALG0000005049表达的检测结果

3．3．7 鸡胚成肌细胞ALDBGALG0000005049敲低模型的建立及相关指标检测结果

3．4 gga-let-7f-3p靶向Selk诱导鸡胚成肌细胞凋亡相关指标检测结果

3．4．2 gga-let-7f-3p对鸡胚成肌细胞中Selk表达的检测结果

3．4．3 gga-let-7f-3p诱导鸡胚成肌细胞氧化损伤指标的检测结果

3．4．4 gga-let-7f-3p诱导鸡胚成肌细胞内质网应激指标的检测结果

3．4．5 gga-let-7f-3p诱导鸡胚成肌细胞凋亡指标的检测结果

3．5 gga-let-7a-3p靶向Selk抑制H5N1在鸡胚成肌细胞复制检测结果

3．5．2 gga-let-7a-3p对鸡胚成肌细胞中Selk表达的检测结果

3．5．3 H5N1感染鸡胚成肌细胞检测结果

3．5．4 gga-let-7a-3p对H5N1复制影响的检测结果

3．5．5 gga-let-7a-3p对鸡胚成肌细胞M2及自噬指标的检测结果

4 讨论

4．1 哈尔滨市鸡缺硒性疾病流行病学情况

4．2 Selk对鸡胚成肌细胞中硒蛋白表达的影响

4．3 Selk对缺硒性骨骼肌炎症反应的影响

4．3．2 ALDBGALG0000005049靶向SCD对鸡胚成肌细胞炎症反应的影响

4．4 gga-let-7f-3p靶向硒蛋白K诱导肌肉凋亡

4．5 gga-let-7a-3p靶向硒蛋白K抑制禽流感病毒在鸡胚成肌细胞上的复制

4．6 Selk对鸡胚成肌细胞发育的影响

4．6．1 Selk对鸡胚成肌细胞发育相关指标的影响

4．6．2 Selk对鸡胚成肌细胞糖代谢相关指标的影响

4．6．3 Selk对鸡胚成肌细胞钙通道相关指标的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文