GlyRS上游激酶的鉴定及GlyRS激酶活性的研究

摘要

乳蛋白合成的机理作为泌乳生物学领域的基础科学问题之一受到广泛的关注，目前在转录和翻译水平上调控乳蛋白合成的信号通路已经被众所周知，但是还有一些细致的生化调控机制还有待于我们进一步研究。实验室的前期结果表明，甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)的544位苏氨酸(T544)和704位丝氨酸(S704)处存在磷酸化现象，并从细胞浆进入细胞核，结合转录因子NFκB1的同时促进NFκB1与β-酪蛋白（β-casein，CSN2）启动子结合，上调CSN2的表达来调控乳蛋白合成。我们推测p-GlyRS可能作为一种新的Ser/Thr蛋白激酶直接激活NFκB1。另外实验室前期成果GlyRS的胞浆相互作用蛋白质组表明几种Ser/Thr蛋白激酶可能是介导氨基酸信号激活GlyRS磷酸化的上游激酶。本研究拟利用体外激酶活性研究方法阐明GlyRS是否直接激活NFκB1以及鉴定GlyRS的上游激酶，以深入揭示GlyRS介导氨基酸信号通过激活NFκB1从而促进乳蛋白合成的信号转导作用的分子机制。
　　本研究对原代奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)进行体外培养并纯化，应用蛋白质免疫印记(WB)和免疫荧光(IF)的方法鉴定了BMECs的纯度和泌乳功能。本实验首先对GlyRS的上游激酶进行了探究。在GlyRS的Co-IP质谱中发现了与其相结合的蛋白激酶p-MAP3K10，利用Co-IP方法验证了在细胞内p-MAP3K10与GlyRS存在相互作用，随后进行了体外激酶实验。GST-GlyRS经E.coli BL21原核诱导表达，并进一步经GST亲和柱纯化得到GST-GlyRS作为底物，同时利用Co-IP富集了p-MAP3K10，进行体外激酶实验。结果显示GlyRS在T544和S704处都发生了磷酸化，但分子质量在80 kDa-100 kDa之间，推测可能在进行体外激酶反应过程中同时发生了降解或剪切。因此进一步进行了p-MAP3K10在6个不同时间点激活GlyRS的体外激酶反应实验，结果表明在p-MAP3K10激活GST-GlyRS的过程中确实出现截短形式的p-GlyRS。以上结果表明p-MAP3K10激活GST-GlyRS使其2个磷酸化位点被磷酸化，确定p-MAP3K10为GlyRS的上游激酶。
　　实验室前期工作已确定p-GlyRS与NFκB1在体内存在直接相互作用，进一步实验以确定p-GlyRS是否能将NFκB1直接激活。经原核诱导并纯化得到GST-NFκB1作为底物，与富集的p-GlyRS进行体外激酶实验，同时将GlyRS与NFκB1的体外激酶实验作为对照。结果显示GlyRS与NFκB1的对照组并没有出现p-NFκB1，而在p-GlyRS与NFκB1实验组，在目的蛋白132 kDa处出现p-NFκB1。为进一步确定p-GlyRS对NFκB1的直接激活作用，设计了p-MAP3K10、GST-GlyRS、GST-NFκB1的连续激活的体外激酶实验。结果显示只有在连续激活组出现了目的蛋白的明显条带，其他对照组并未产生p-NFκB1，提示p-NFκB1的产生是由一系列的激活作用完成的。
　　为了给予更直接的p-GlyRS激活NFκB1的实验证据，我们选择利用纯化的p-GlyRS进行体外激酶反应实验。构建pCMV-C-Flag-GlyRS真核表达载体，将其转入细胞中，提取胞核蛋白，利用Flag纯化试剂盒和磷酸化试剂盒进行连续纯化，得到纯化产物为单一的磷酸化蛋白，western blotting鉴定为p-GlyRS。利用纯化后的p-GlyRS蛋白与GST-NFκB1进行体外激酶实验，应用anti-phospho-Ser/Thr/Tyr抗体经western blotting检测磷酸化蛋白，并利用Flag抗体检测pCMV-C-Flag-GlyRS表达产物，结果显示在目的分子质量处出现p-NFκB1。本实验进一步证明GlyRS具有激酶活性。利用生物信息学分析比较了GlyRS与Ser/Thr激酶的催化结构域的相似序列，发现Ser/Thr激酶结构域的显著特征也存在于GlyRS中，进一步提高了GlyRS可能具有Ser/Thr蛋白激酶活性的可能性。
　　综上所述，p-MAP3K10使GlyRS在T544和S704处发生磷酸化，确定p-MAP3K10为GlyRS的上游激酶。同时p-GlyRS能够激活NFκB1，使其磷酸化为p-NFκB1，推测GlyRS具有很大可能性是一种新的激酶。后续开展关于GlyRS的激酶活性的分子结构基础的研究，将深入揭示GlyRS这一非经典的分子机制。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育与泌乳

1．2 奶牛乳蛋白合成机理及调控

1．3 MAP3K10激酶相关研究

1．3．1 蛋白激酶的分类和分子结构特征

1．3．2 MAP3K10激酶的功能研究

1．4 NFκB相关研究

1．4．2 NFκB的功能研究

1．5 氨酰tRNA合成酶的功能研究

1．5．1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能

1．5．2 甘氨酰tRNA合成酶相关研究

1．6 实验目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验动物与细胞

2．1．4 主要溶液的配制

2．2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化、鉴定

2．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养、纯化

2．2．2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

2．2．3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏

2．3 GlyRS基因的原核诱导及蛋白纯化

2．3．1 RNA提取及反转录

2．3．2 GlyRS引物设计及PCR扩增

2．3．3 p-GEX-4T-1-GlyRS(GST-GlyRS)原核表达载体构建

2．3．4 重组蛋白诱导表达及纯化

2．4 p-MAP3K10与GlyRS的激酶反应

2．4．1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-MAP3K10与GlyRS的相互作用

2．4．2 p-MAP3K10激活GlyRS的激酶反应

2．4．3 p-MAP3K10在不同时间点激活GlyRS的激酶反应

2．6 p-GlyRS与NFκB1的激酶反应

2．6．4 p-MAP3K10、GST-GlyRS、GST-NFκB1的连续激活反应

2．7 GlyRS基因的过表达载体构建及蛋白纯化

2．7．1 引物设计及PCR扩增

2．7．2 构建pCMV-C-Flag-GlyRS真核表达载体

2．7．3 重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞

2．7．4 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定

2．7．5 Flag纯化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS

2．7．6 磷酸化试剂盒进行二次纯化

2．8 纯化后的p-GlyRS蛋白与NFκB1激酶反应

3 结果与分析

3．1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化及其鉴定

3．1．1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化

3．1．2 乳腺上皮细胞的鉴定

3．2 GlyRS基因的原核诱导及蛋白纯化

3．2．1 RNA提取及反转录结果

3．2．3 p-GEX-4T-1-GlyRS(GST-GlyRS)原核表达载体

3．2．4 重组蛋白诱导表达及纯化结果

3．3 p-MAP3K10与GlyRS的激酶反应

3．3．2 p-MAP3K10激活GlyRS的激酶反应

3．3．3 p-MAP3K10在不同时间点激活GlyRS的激酶反应

3．4 NFκB1基因的原核诱导及蛋白纯化

3．4．2 p-GEX-4T-1-NFκB1(GST-NFκB1)原核表达载体

3．4．3 重组蛋白诱导表达及纯化结果

3．5 p-GlyRS与NFκB1的激酶反应

3．5．3 p-GlyRS激活NFκB1的激酶反应结果

3．6 GlyRS基因的过表达载体构建及蛋白纯化

3．6．1 引物设计及PCR扩增结果

3．6．2 pCMV-C-Flag-GlyRS真核表达载体

3．6．3 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定结果

3．6．4 Flag纯化试剂盒纯化pCMV-C-Flag-GlyRS

3．6．5 磷酸化试剂盒进行二次纯化结果

3．7 纯化后的p-GlyRS蛋白与NFκB1激酶反应结果

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养、纯化、鉴定

4．3 p-GlyRS激活NFκB1的激酶反应

4．3．2 p-MAP3K10、GST-GlyRS、GST-NFκB1连续激活反应

4．3．3 纯化后的p-GlyRS蛋白与NFκB1激酶反应

4．3．4 GlyRS是激酶的可能分子结构基础

4．4 GlyRS相关新的信号通路的生物学意义

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文