阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm体内外抑制机制研究

摘要

恶性肿瘤严重危害人类的健康，并已成为现阶段重大的公共医疗问题。探寻有效的治疗恶性肿瘤的方法早已成为世界各国医学研究的重点。近年来随着我国社会的发展，人们的生活方式和所处生态环境的改变导致了恶性肿瘤的发病形势极为严峻，造成社会负担日益加剧，其中乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤性疾病。近年来的流行病学调查显示，乳腺癌的发病率和致死率均有逐年上升的趋势。
　　阿司匹林作为经典的非甾类抗炎药，具有解热、镇痛、抗风湿、防治心脑血管疾病等功效，被广泛应用于临床各领域。近年来随着对阿司匹林药理作用研究的深入，越来越多的证据表明其具有抗肿瘤效应。服用阿司匹林可降低癌症的发生风险，并有效的延长癌症患者的生存期和降低其癌症的复发。目前，大量的实验结果显示阿司匹林可以在体内外抑制多种肿瘤细胞的增殖活性。随后人们对阿司匹林发挥抗肿瘤效应的具体分子机制开展了大量的科学探索，然而从现有报道来看，阿司匹林的抗肿瘤作用机制还未得到完全揭示，这是因为其药理作用较为复杂，并可在不同的肿瘤细胞中表现出不同的作用途径，同时缺乏系统和完善的在体实验，这也限制了阿司匹林在肿瘤临床中的应用。相比较结肠癌等消化道恶性肿瘤来说，阿司匹林对于乳腺肿瘤作用效果的报道相对较少，对于其抗癌机制的研究也缺乏系统的阐述，且在一些问题上还存在明显的争议。
　　犬乳腺肿瘤为兽医临床上常见的肿瘤性疾病，对犬的健康造成严重危害，目前临床上主要采取手术切除的方法来对其进行治疗。与人类乳腺肿瘤相同，对于恶性并伴有转移的犬乳腺肿瘤来说，单纯的手术治疗效果并不理想，手术配合系统的辅助治疗方案对于犬乳腺肿瘤显得尤为必要。由于犬和人类的生活环境息息相关，其一直作为医学研究中理想的实验动物模型。此外，犬乳腺肿瘤和人乳腺肿瘤无论是在发病病因和病程发生发展等方面，都具有高度相似性。开展犬乳腺肿瘤的研究不仅能为兽医临床探寻犬乳腺肿瘤有效的治疗方案，更可以为人医临床提供重要的数据参考。
　　基于阿司匹林的前期研究基础和犬作为乳腺肿瘤研究模型的重要意义，且目前并未见有阿司匹林对犬乳腺肿瘤的研究报道，本课题开展阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞的抑制作用及其分子机制的研究，进一步揭示阿司匹林的抗肿瘤作用机制，为下一步在犬乳腺肿瘤模型中评价阿司匹林的抗肿瘤作用提供理论依据，并为阿司匹林能早日应用于乳腺肿瘤的临床治疗奠定一定的基础。本实验通过CCK-8和克隆形成实验的方法，检测不同浓度阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞增殖活性的影响，并建立了裸鼠犬乳腺肿瘤移植瘤模型，进一步观察阿司匹林在体内的抗肿瘤效果。采用AnnexinⅤ-FITC染色法，检测阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞的凋亡诱导作用，同时通过western blot实验检测阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞中PARP、Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响。流式细胞术检测了阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞周期分布的影响，通过western blot实验检测了Cyclin D1、CDK4、E2F1和p21蛋白的表达变化，以揭示阿司匹林阻滞细胞周期进程的机制。Western blot实验检测阿司匹林处理犬乳腺肿瘤细胞后，PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达水平变化，并提取核内蛋白，进一步检测阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞核内β-catenin蛋白水平的影响，同时通过应用细胞免疫荧光和免疫组织化学染色实验，检测阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞内p-GSK3β和β-catenin蛋白定位及表达水平的影响，探究阿司匹林抑制犬乳腺肿瘤细胞增殖的分子调节机制。采用Transwell小室实验检测阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞迁移力及侵袭力的影响，并结合westernblot实验检测了阿司匹林处理后的犬乳腺肿瘤中VEGF和E-cadherin蛋白表达水平的变化，以阐述阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞转移能力的影响。评估阿司匹林与顺铂或他莫昔芬的联合应用效果，以奠定阿司匹林与其联合应用的理论基础。
　　实验结果表明:
　　(1)阿司匹林在体外可以抑制犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm的增殖活性，并抑制犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm的克隆形成，且呈剂量和时间依赖性;体内实验结果证明，阿司匹林抑制了裸鼠犬乳腺肿瘤移植瘤的生长，表明阿司匹林在体外与体内对犬乳腺肿瘤细胞均具有增殖抑制效应。
　　(2)通过细胞凋亡检测实验证明，阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞CHMp没有凋亡诱导作用，且不影响CHMp细胞内PARP、Bcl-2和Bax蛋白的表达;在10mM阿司匹林作用下，犬乳腺肿瘤细胞CHMm可发生晚期凋亡和坏死，细胞内PARP蛋白被切割，且Bcl-2/Bax的比值发生显著性下降，表明高浓度阿司匹林具有诱导转移型犬乳腺肿瘤细胞CHMm发生晚期凋亡和坏死的作用。阿司匹林诱导犬乳腺肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，并下调了Cyclin D1、CDK4、E2F1蛋白在细胞内的表达水平，上调了p21蛋白的表达水平，表明阿司匹林可通过诱导犬乳腺肿瘤细胞周期阻滞发挥抗肿瘤效果，
　　(3)通过检测PI3K/Akt信号通路中相关蛋白实验，阿司匹林通过下调犬乳腺肿瘤细胞中PI3K、p-Akt蛋白的表达水平，抑制PI3K/Akt信号通路。
　　(4)阿司匹林抑制Wnt/β-catenin信号通路，主要是下调p-GSK3β、β-catenin蛋白的表达水平，同时抑制β-catenin蛋白的核内表达水平，抑制其下游的调节分子c-myc、PPAR-δ的表达。阿司匹林降低VEGF和增加E-cadherin蛋白在犬乳腺肿瘤细胞中的表达水平，阻止犬乳腺肿瘤细胞的迁移及侵袭，进而抑制其转移能力。
　　(5)阿司匹林分别与顺铂、他莫昔芬表现出药效相加的作用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 犬乳腺肿瘤的临床特点和治疗现状

1．2 犬乳腺肿瘤的参考意义

1．3 阿司匹林及其药理作用

1．3．1 阿司匹林的药理性质

1．3．2 阿司匹林的药物代谢及药物效应动力学

1．4 阿司匹林的抗肿瘤作用

1．4．1 阿司匹林抑制恶性肿瘤的研究进展

1．4．2 阿司匹林抑制肿瘤细胞的基础研究进展

1．4．3 阿司匹林的抗肿瘤活性

1．4．4 阿司匹林抑制肿瘤的作用机制研究

1．5 实验研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 实验动物

2．1．3 实验药物及配制方法

2．1．4 主要抗体

2．1．5 主要试剂

2．1．6 主要仪器设备

2．1．7 常用溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 犬乳腺肿瘤细胞的培养和传代

2．2．2 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞体外增殖能力的影响实验

2．2．3 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞体内增殖能力影响的检测

2．2．4 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm凋亡影响的检测

2．2．5 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm细胞周期影响的检测

2．2．6 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm中Wnt／β-catenin信号通路影响的检测

2．2．7 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm中P13K／Akt信号通路影响的检测

2．2．9 阿司匹林与顺铂、他莫昔芬联合应用对CHMp和CHMm抑制效果检测

2．2．10 统计学分析

3 实验结果

3．1 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞的体外增殖能力的影响

3．2 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞克隆形成能力的影响

3．3 阿司匹林对裸鼠犬乳腺肿瘤细胞CHMm移植瘤的影响

3．3．1 犬乳腺肿瘤裸鼠皮下移植瘤的形成

3．3．2 阿司匹林对犬乳腺肿瘤移植瘤裸鼠的生理状况影响

3．3．3 阿司匹林对犬乳腺肿瘤移植瘤裸鼠的肿瘤体积及重量的影响

3．3．4 裸鼠移植瘤瘤体的组织形态学特征

3．4 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞凋亡的影响

3．5 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞中Bcl-2／Bax的影响

3．6 阿司匹林诱导犬乳腺肿瘤细胞阻滞在G0／G1期

3．7 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞Wnt／β-catenin信号通路的影响

3．7．1 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞Wnt／β-catenin信号通路蛋白及其下游分子的影响

3．7．2 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞核内β-catenin蛋白水平的影响

3．7．3 阿司匹林对p-GSK3β、β-catenin蛋白在犬乳腺肿瘤细胞中的定位情况的影响

3．7．4 阿司匹林对裸鼠移植瘤细胞中p-GSK3β、β-catenin蛋白表达的影响

3．7．5 FH535对犬乳腺肿瘤细胞体外增殖能力的影响

3．8 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞中NF-κB、Cox-2蛋白表达的影响

3．9 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞中P13K／Akt信号通路的影响

3．10 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞迁移与侵袭能力的影响

3．11 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞中VEGF、E-cadherin蛋白表达的影响

3．12 阿司匹林与顺铂、他莫昔芬联合对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制效果

4 讨论

4．1 阿司匹林抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖

4．2 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞的凋亡诱导效应

4．3 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞周期的影响

4．4 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞Wnt／β-catenin通路的影响

4．5 阿司匹林对犬乳腺肿瘤细胞转移能力的影响

4．6 阿司匹林与顺铂、他莫昔芬联合对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制效果

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文