表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价

摘要

猪圆环病毒(Porcine circoviru，PCV)是圆环病毒科，圆环病毒属的成员，分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1不致病，但PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、先天性震颤和猪皮炎肾炎综合征等多种疾病，急性暴发时猪群的死亡率可达50％，对养猪产业危害严重。在PCV1与PCV2的基因组中约含有11个开放阅读框(ORF)，PCV的复制蛋白Rep由ORF1编码，病毒衣壳蛋白Cap主要由ORF2基因编码。ORF2编码的结构蛋白Cap是病毒主要的保护性抗原，与病毒免疫机制关系紧密，是临床研制PCV亚单位疫苗的首选蛋白。乳酸乳球菌由于自体分泌的外源蛋白少，作为亚单位疫苗的宿主载体，重组菌具有可以直接饲喂不需纯化的优点。本实验将以乳酸乳球菌作为宿主菌，利用pH诱导型表达载体pAMJ399构建表达Cap蛋白的重组乳酸乳球菌。该菌株在发挥乳酸菌益生作用的同时亦可表达Cap蛋白，作为防制猪圆环病毒病的重组亚单位活载体疫苗，为PCV新型口服疫苗的研究提供新思路。
　　本实验通过PCR扩增获得了含有两个酶切位点BglⅡ和PstⅠ并去除核定位信号序列的PCV2 Cap基因片段约579 bp，将Cap基因与乳酸乳球菌表达质粒pAMJ399连接，转化入大肠杆菌感受态TG1中，获得重组质粒pAMJ399-Cap，再将重组质粒电转入乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中，获得重组乳酸乳球菌pAMJ399-Cap/MG1363。SDS-PAGE检测可见诱导后的重组菌pAMJ399-Cap/MG1363在约28 kDa处出现与预期结果大小相符合的目的带，以PCV2单克隆抗体3C11上清进行Western blot检测，可见重组菌pAMJ399-Cap/MG1363在约28 kDa处出现了特异性的反应带，表明Cap蛋白在重组乳酸乳球菌pAMJ399-Cap/MG1363中获得了表达。间接免疫荧光实验和ELISA检测结果表明表达的Cap蛋白即可分泌于培养液中，同时也分布于菌体表面。
　　对构建的重组乳酸乳球菌pAMJ399-Cap/MG1363进行生物安全性评价。通过重组菌在模拟消化道环境中的生存性能以及口服后在消化道内的存留情况分析，结果显示重组菌在pH3.5的胃液环境下作用5h存活率为63.09％，在肠液环境下重组菌可存活24 h以上，对5％的盐浓度具有较好的耐受能力。单次灌胃重组菌后4h，小鼠空肠和结肠均检测到较强的重组菌存留信号，荧光强度显著高于对照组;8 h时，各肠段荧光信号均较弱，表明重组菌存留较少;连续灌胃4天，在第5d检测时，重组菌在空肠、回肠和结肠各肠段均有明显的荧光信号，表明均有重组菌的存留，而在检测的第6d和11d，除空肠和回肠没有荧光信号外，结肠均有明显的荧光信号，可见重组菌可在肠道内存留10天以上。
　　为进一步探讨重组乳酸乳球菌的免疫效果，本实验以小鼠作为实验动物，进行口服免疫。实验共分为3组:实验组口服免疫重组菌pAMJ399-Cap/MG1363，剂量4×107CFU/只;对照组分为空载体组与PBS组，分别口服免疫空载体菌pAMJ399/MG1363，剂量4×107 CFU/只和相同体积的PBS。免疫程序为:免疫两次，每次免疫间隔2周，每次连续免疫3天，每天免疫一次。在免疫前和免疫后不同时间收集粪便、血清和肠黏液样品，分别通过ELISA方法检测粪便中特异性sIgA水平、血清中特异性IgG水平和肠黏液中特异性sIgA水平。结果显示，重组菌口服免疫小鼠，可以提高小鼠的日采食量，增加日增重量;免疫重组菌pAMJ399-Cap/MG1363的小鼠sIgA和IgG水平均高于对照组，表明口服乳酸乳球菌既可诱导机体产生局部的黏膜免疫应答，又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。IL-4和IFN-γ两种细胞因子的检测结果表明，重组菌组和空载体组在免疫后有明显升高趋势，与PBS组相比，差异显著。表明在免疫重组菌后既可以诱导机体产生细胞免疫应答也可以产生体液免疫应答。
　　本实验构建的重组乳酸乳球菌pAMJ399-Cap/MG1363可稳定表达PCV2 Cap蛋白并具有良好的安全性，口服免疫可以诱导机体产生特异性免疫应答。本研究为重组乳酸乳球菌口服疫苗防制猪圆环病毒病奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪圆环病毒病的流行与危害

1．2 猪圆环病毒的病原学特征

1．2．1 PCV基因结构及病毒蛋白生物学活性

1．2．2 PCV感染及其致病相关机理

1．3 PCV2疫苗研究进展

1．4 乳酸菌表达系统的研究进展

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒、菌种

2．1．2 抗体制剂

2．1．3 实验动物

2．1．4 引物

2．1．5 试剂

2．1．6 溶液配置

2．1．7 主要实验仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 表达PCV2 Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建

2．2．2 重组乳酸乳球菌的诱导及表达蛋白的鉴定

2．2．3 重组乳酸乳球菌在动物体内的存留性能分析

2．2．4 口服乳酸乳球菌免疫学指标的测定

2．2．5 数据统计

3 实验结果

3．1 表达PCV2 Cap重组乳酸乳球菌的构建

3．1．1 目的基因的PCR扩增结果

3．1．2 重组质粒pMD19-T-Cap的鉴定结果

3．1．3 重组表达质粒pAMJ399-Cap的鉴定

3．2 重组乳酸乳球菌的诱导及表达蛋白鉴定

3．2．1 重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot鉴定

3．2．2 重组蛋白的间接免疫荧光检测

3．2．3 重组蛋白的间接ELISA检测

3．3 重组乳酸乳球菌的安全性评价结果

3．3．1 重组乳酸乳球菌生长动态分析结果

3．3．2 重组乳酸乳球菌在消化道环境中的生存性能分析结果

3．3．3 重组乳酸乳球菌在消化道内的存留能力分析结果

3．3．4 重组乳酸乳球菌对动物生产性能的影响

3．4 口服乳酸乳球菌免疫学指标的测定

3．4．2 免疫小鼠粪便中抗PCV2-Cap特异性抗体sIgA的测定结果

3．4．3 免疫小鼠肠黏液中抗PCV2-Cap特异性抗体sIgA的测定结果

3．4．4 免疫小鼠血清中细胞因子测定结果

4 讨论

4．1 目的基因的选择

4．2 重组蛋白在宿主菌中的表达

4．3 重组菌在消化道内的存留情况

4．4 重组菌作为口服疫苗的安全性评价

4．5 重组菌口服免疫效果的评价

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文