番茄SlHZ45基因在表皮毛发育中的角色

摘要

植物表皮毛是植物在长期进化过程中为了应对生物和非生物逆境胁迫而演化出来的一类特殊的由表皮细胞向外延伸形成的发状结构，其广泛分布于陆地植物地上部分的体表。植物表皮毛是植物体细胞分化的模式系统，越来越多的研究投入到对不同植物中表皮毛的发生调控机理、作用和有关调控基因的发现与功能分析等方面的研究当中。目前以拟南芥单细胞表皮毛相关基因的克隆、功能分析和调节机理的研究最为透彻。而番茄、烟草的表皮毛为多细胞结构与拟南芥差异很大，因此拟南芥的表皮毛的调控机理并不适用于番茄和烟草等植物。番茄SlHZ45基因能够显著的促进Ⅰ型、Ⅳ型表皮毛发生，极显著的促进Ⅵ型表皮毛发生。因此，对SlHZ45基因的分离和相关功能的研究对于今后多细胞表皮毛的发育机制和调控机理的探索具有重要的意义。
　　由于表皮毛具有的特殊形态结构以及腺体表皮毛毛分泌次级代谢产物的多样性，因此表皮毛（尤其是腺毛）对于植物抵御逆境胁迫具有一定的作用。SlHZ45基因促进番茄表皮毛发生的类型均为腺体表皮毛。因此，推断该基因的具有一定的逆境抵抗能力。对该基因的研究亦为今后的番茄抗性育种提供良好的资源材料。
　　本研究通过对T1代转SlHZ45基因烟草和T0代SlHZ45基因超表达番茄植株表皮毛类型分析，逆境胁迫下T1代转SlHZ45基因烟草萌发试验以及逆境胁迫下SlHZ45基因的表达模式分析等试验，探索SlHZ45基因的相关功能，主要研究结果如下:
　　1.建立番茄SlHZ45基因转化体系，与普通栽培番茄品种进行表皮毛类型和数量的观察比较分析。结果发现，SlHZ45基因超表达植株叶表皮毛与对照组相比，叶缘上Ⅰ型、Ⅳ型表皮毛数量分别增加45.80％、50.00％，且两种表皮毛均为腺体毛。SlHZ45基因超表达植株茎表皮毛与对照组相比，Ⅵ型表皮毛数量极显著的发生，增长率为395.84％，Ⅵ型同样为腺体毛。花表皮毛与对照组相比较不论是花瓣、花托上表皮毛的数量和类型上均无显著差异。SlHZ45基因超表达植株总表皮毛数量明显增加，表皮毛总数增加48.66％，且数量增加的表皮毛均为腺体毛。
　　2.T1代转SlHZ45基因烟草表皮毛类型分析，SlHZ45基因对促进烟草腺毛的发生有显著的作用，而对总体数量上的促进作用不是十分明显，这与番茄超表达植株表皮毛类型上的变化规律一致，SlHZ45基因能够显著或极显著的促进植株腺体毛的发生，而抑制部分非腺体毛的发生。
　　3.利用semi RT-PCT和Real-time PCR技术对低温、高盐、干旱胁迫下番茄根、茎、叶、花和果5个部位进行SlHZ45基因的表达分析。结果显示，SlHZ45基因在各个部位均有表达，在根、果中表达量极低，在花中表达量最高。3种胁迫下根、果中基因表达量仍相对较低，盐处理中花器官中该基因表达量最高并且在6h出现峰值，冷胁迫中茎、叶和花均在3h时出现峰值，且相对表达量接近，干旱胁迫下花中6h表达量峰值最高。随着处理时间延长，SlHZ45基因在茎、叶、花中的表达量在3 h-6h中均显著的提高。因此，可以推断SlHZ45基因受逆境胁迫的诱导，在抵御逆境胁迫中发挥作用。同时进行了T1代烟草的逆境胁迫处理，SlHZ45基因的表达规律与番茄中该基因表达规律吻合。
　　4.20 mM盐和20％PEG条件下进行了T1代烟草种子萌发试验。结果发现，转SlHZ45基因烟草种子萌发速率以及终萌发率均显著的高于对照组。可以推测，SlHZ45基因在种子萌发期对逆境起到一定的抵抗作用。
　　5.在根长测定实验中，转基因烟草根长长于对照组0.5 cm左右，侧根分支多于照组。盐胁迫中，转基因烟草根系均长于对照组，且侧根分支多于对照组。干旱胁迫中根系长度变化规律与盐胁迫时基本相同，转基因烟草根系均长于对照组，且侧根分支多于对照组。
　　6.利用在线软件对SlHZ45基因启动子序列进行预测和生物信息学分析，结果表明:启动子序列中除了存在核心启动子元件和大量的CAAT box外还含有多个已报道的顺式作用调控元件如:AE-box、GA-motif、 GAG-motif、TCT-motif、ATGCAAAT motif、Skn-1-motif、Circadian、TC-rich repeats-motif、HSE-motif、GARE-motif、GAGTA-motif等。说明SlHZ45基因很有可能是在多重转录信号共同调控下完成的表达。

目录

声明

摘要

1 引言

1．2．1 植物表皮毛发生机制的研究进展

1．2．2 植物表皮毛相关的抗性研究

1．2．3 SlHZ45启动子生物信息学分析

1．3 本研究的内容和技术路线

1．3．1 研究内容

1．3．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 主要试剂和仪器

2．3．3 T1代转基因烟草体视显微镜观察

2．4 番茄的遗传转化

2．4．1 主要试剂配制

2．4．2 SlHZ45基因表达载体的活化

2．4．3 番茄遗传转化

2．4．4 转基因植株的PCR检测

2．4．5 超表达植株形态观察

2．5 番茄中SlHZ45基因逆境胁迫表达分析

2．5．1 SlHZ45基因在Heinz番茄中表达量分析

2．5．2 低温胁迫表达处理

2．5．3 盐胁迫表达处理

2．5．4 干旱胁迫表达处理

2．5．5 样品RNA提取及纯化

2．5．6 cDNA第一条链的合成

2．5．8 荧光定量PCR检测SlHZ45基因表达

2．6．2 T1代转SlHZ45基因烟草逆境胁迫下种子萌发实验

2．7 SlHZ45基因启动子序列的生物信息学分析

3 结果与分析

3．1．2 体视显微镜观察结果分析

3．2 SlHZ45基因超表达番茄转化体系的构建

3．2．1 转基因番茄植株的筛选、驯化

3．2．2 转基因番茄PCR鉴定

3．3 转SlHZ45基因番茄植株与普通栽培番茄的形态学差异

3．3．1 体视显微镜观察结果分析

3．3．2 扫描电子显微镜观察结果分析

3．3．3 超表达SlHZ45基因对番茄表皮毛发生的综合分析

3．4 SlHZ45基因逆境胁迫下表达量分析

3．4．2 番茄中SlHZ45基因逆境胁迫下表达量分析

3．4．3 T1代转SlHZ45基因烟草中SlHZ45基因逆境胁迫下表达量分析

3．5 SlHZ45基因启动子序列分析

4 讨论

4．1 番茄中不同类型表皮毛作用分析

4．2 SlHZ45基因在植株表皮毛发生过程的作用分析

4．3 SlHZ45基因在番茄抗性育种中应用前景的分析

4．4 本实验的创新点

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文